[发明专利]分离的双加氧酶及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种分离的酶，为一种α‑酮戊二酸依赖型双加氧酶，可催化对映‑贝壳杉烯酸的C‑2位羟化生成2‑羟基对映贝壳杉烯酸，本发明还涉及编码所述酶的基因，包含所述基因的表达载体、以及含有表达载体的重组工程菌，可用于2‑羟基对映贝壳杉烯酸的生产。

技术领域

本发明涉及一种分离的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶Tw2ODD5及其编码基因，可催化对映-贝壳杉烯酸C-2位羟化，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是传统中药雷公藤的植物来源，具有清热解毒，祛风除湿，杀虫止痒，消肿散结等功效(高伟,刘梦婷,程琪庆,等.雷公藤的本草考证[J].世界中医药,2012,7(6):560-562.)。现代研究表明雷公藤可用于风湿性关节炎,肾小球肾炎,肾病综合征等病的治疗。萜类成分是雷公藤的主要活性成分，贝壳杉烷型二萜是其中的重要组成部分。从中药的活性成分中开发新药是一种很有前景的方式，然而由于植物的生长缓慢且药用成分含量很低，大大限制了其应用。近年来利用合成生物学技术设计和改造微生物菌株来生产天然活性产物已经成为一种极具潜力的获取方法。

萜类化合物在高等植物中的合成途径主要有两种，位于细胞质中的MVA途径和位于质体中MEP途径,通过以上两个途径生成萜类的共同前体异戊烯基焦磷酸(IPP)及其同分异构体二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)；在异戊烯转移酶的催化下，生成GGPP前体，再由二萜合酶(Diterpene synthase)催化形成二萜烯中间体母核结构(Su P.*,Gao L.H.*,Liu S.,et al.Probing the function of protein farnesyltransferase in Tripterygiumwilfordii[J].Plant Cell Reports,2019,38(2):211-220)，然后母核在氧化酶、甲基转移酶等后修饰酶的作用下生成复杂多样的二萜类活性化合物。

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶(2-oxoglutarate/Fe(II)-dependentdioxygenases,2-ODDs),是一类不含血红素的单核铁原子蛋白，与细胞色素P450单加氧酶相比，2-ODDs反应时仅需要2个或者3个配体，因此具有更高的灵活性，其所催化的反应更具多样性和复杂性(Farrow和Facchini2014)。2-ODDs是一个庞大的基因家族,一般根据其氨基酸序列BLAST P值分为3个具有明显差异的亚家族，分别是DOXA、DOXB和DOXC(Kawai等2014)，其中DOXA和DOXB调控植物关键的生长发育过程,如初生代谢、多肽链的翻译后修饰等，在数量和蛋白序列上具有较高的保守性。DOXC亚家族参与植物的次生代谢,包括酚酸类,生物碱类以及萜类成分等,它在不同植物体内数量和功能差异较大,具有较大的物种间特异性(Kawai等2014)。这三类2-ODDs在植物界中广泛存在,可以催化羟基化反应、去甲基化反应、开环反应、去饱和反应、闭(成)环反应和卤化反应等(Islam等2018)。

张逸风等人成功鉴定了雷公藤中的首个α-酮戊二酸依赖型双加氧酶TwGA13ox,，体外酶促研究证实其可以催化赤霉素A9的C13位发生氧化，生成赤霉素A20。本发明从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条α-酮戊二酸依赖型双加氧酶基因Tw2ODD5。通过体外酶促反应验证其皆具有催化对映-贝壳杉烯酸(ent-kauranoic acid，缩写KA)的C2位发生氧化生成相应羟化产物的功能。该基因是从雷公藤中首次克隆得到的，在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的雷公藤2ODD酶基因及其氨基酸序列。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种分离的酶，所述酶参与二萜类化合物的生物合成，尤其是贝壳杉烷型二萜类化合物，如2-羟基对映贝壳杉烯酸。