[发明专利]一种抑制镰孢菌生长的分子生物学方法

说明书

本发明属于食品防腐技术领域，公开了一种氨基酸添加通过Tap42基因调控抑制镰孢菌生长的方法，本发明通过分子生物学的方法，构建基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42‑C，经向野生株、以及构建的基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42‑C中添加不同种类的氨基酸，发现一些特定的氨基酸可以显著抑制尖孢镰孢菌的生长，从而为未来食品的防腐保鲜提供新的方法奠定基础。

技术领域

本发明涉及食品防腐技术领域，更具体地，涉及一种抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法。

背景技术

真菌细胞中，TORC1可感知环境中的营养物质、生长因子、压力等信号，来参与调节蛋白质翻译、核糖体合成、基因转录等信号通路，进而调节真菌的生长及代谢。上游响应元件Gtr1与Gtr2结合为异源二聚体，可介导上游多个信号通路，进而通过下游效应器调控细胞的生理过程，而下游支路中，Sch9与Tap42作为代谢效应元件，可响应上级通路传导的信号因子并通过下游调控镰孢菌的生长代谢。但Gtr1、Gtr2、Sch9与Tap42单一元件由TORC1通路介导对菌丝生长及次生代谢物生成的调控作用，目前还未有报道。

氨基酸作为TORC1信号通路的激活因子，具有显著调控细胞功能的作用。氨基酸根据性质的不同，可分为酸性氨基酸、碱性氨基酸、支链氨基酸、含硫氨基酸等。在不同种类的氨基酸激活下，可通过真菌TORC1元件传达不同的响应信号，对特定氨基酸进行响应，并通过下游支路的协同作用吸收利用于生长代谢。但目前对不同种类的氨基酸如何调控镰孢菌的生长与代谢，目前还没有深入研究。

发明内容

本发明为了克服现有技术中存在的上述缺陷，首先提供了一种抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法。

本发明的第二个目的是提供上述方法在食品防腐的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法，包括以下步骤：

S1、分别构建尖孢镰孢菌基因敲除株△FoTap42和尖孢镰孢菌基因回补株△FoTap42-C；

S2、分别向尖孢镰孢菌野生株、基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42-C中添加氨基酸，所述氨基酸选自L-Arg、L-Asp、L-Glu、L-Cys、L-Met、L-Tyr、L-Ser、L-Leu中的至少一种。

优选的，S1所述尖孢镰孢菌基因敲除株△FoTap42的构建方法包括以下步骤：

(1)、设计扩增Tap42基因左右同源臂的引物，以尖孢镰孢菌野生型菌DNA为模板，分别PCR扩增Tap42基因的左右同源臂；

(2)、纯化的左右同源臂PCR产物经过酶切后，分别连接到基因敲除载体pBluescript KS(+-)(pBS)-HPH1的潮霉素抗性基因的前、后的多克隆位点上，得到重组的基因敲除载体得到重组的基因敲除载体pPBS-HPH-Tap42-5’3’；

(3)、以重组载体pPBS-HPH-Tap42-5’3’为模板，用引物扩增得到长度约为3,000bp的敲除大片段HPH-Tap42-5’3’；

(4)、通过原生质体转化，将Tap42的敲除结构转化尖孢镰孢菌的原生质体细胞。转化后原生质体通过潮霉素HYG平板筛选，25℃条件下培养至转化子长出。

优选的，S1所述尖孢镰孢菌基因回补株△FoTap42-C的构建方法包括以下步骤：

(1)、以连接Tap42基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物扩增Tap42基因。PCR产物经过纯化后，利用HD Cloning Kit连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300-neo上，并测序进行验证；