[发明专利]定量细菌生物膜中的内毒素负荷

说明书

本文公开了用于定量生物膜样品中的总内毒素负荷的方法。还提供了用于鉴定革兰氏阴性生物膜衍生的细菌感染的方法。所公开的方法更准确地定义实际的总内毒素水平，并且能够以比当前提取技术更高的分辨率来检测给定生物膜体积中内毒素的存在。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年4月9日提交的美国临时申请号63/007,430的优先权权益，该申请的全部内容据此以引用方式并入。

技术领域

本公开涉及定量生物膜中的内毒素的方法。

背景技术

目前，许多医疗装置(诸如例如硬脑膜替代补片、疝网和伤口敷料)由细菌衍生的纤维素制造，该细菌衍生的纤维素是一种形式的生物膜。用于生产纤维素的某些细菌包括革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌特有的一个问题是内毒素的存在。内毒素，也称为脂多糖，是革兰氏阴性细菌的细菌细胞壁结构的一部分。它们是已知的热原，并且在从细胞壁释放时，诸如在细胞分裂或细胞死亡期间是体内炎症过程的贡献者。

为了获得监管批准，使用革兰氏阴性细菌或用革兰氏阴性细菌产生的产品必须进行处理以使它们无热原。

FDA批准的细菌内毒素测试(BET)标准是鲎变形细胞溶解物(LAL)测定。在ANSI/AAMI ST72:2011、USP85和USP161中概述了用于医疗装置的该测试。该测定涉及使样品与来自美洲鲎(Limulus Polyphemus)的变形细胞溶解物接触。该测定有三种变型形式，包括凝胶-凝块技术、比浊技术和显色技术。凝胶-凝块法是最简单和最广泛使用的LAL测试，并且依赖于凝胶的形成。比浊技术依赖于内源底物裂解后样品中浊度的发展。显色技术基于裂解合成肽-色原复合物后样品中颜色的发展。在测试结果冲突的情况下，凝胶-凝块测试被认为是决定性的测试方法。

目前，医疗装置上的BET依赖于间接提取方法来定量内毒素单位(EU)。通常将样品浸入无热原的水中并加热至接近体温(例如，37℃)持续至少一小时。取水中的提取物，并且用LAL测定测试内毒素量。从该间接测量来确定医疗装置的EU值。根据医疗装置的预期用途，FDA设定可接受的阈值EU值。

从临床角度来看，目前在患有生物膜衍生的细菌感染的患者中不易检测到生物膜。为了鉴定抗生素治疗过程，通常培养来自患者的组织样品，并且然后鉴定细菌生长。该过程是耗时的，并且只能测量在选定温育条件下能够在所选择的琼脂上生长的活细菌细胞的数量。在某些条件下，没有检测到来自生物膜样品的存活的革兰氏阴性细菌。在感染衍生自革兰氏阴性生物膜的情况下，内毒素的存在可提供鉴定患者体内生物膜感染的存在的替代方法。

发明内容

本公开涉及定量生物膜中的内毒素的方法。本文公开的方法更准确地定义实际的总内毒素水平，并且能够以比利用当前提取技术低得多的水平来检测给定生物膜体积中内毒素的存在。因此，本文所述的方法是对本领域方法的当前状态的改进，并且可另外用于确定患有革兰氏阴性细菌感染的患者体内潜在的生物膜衍生的感染。

根据本公开，用于定量生物膜中内毒素浓度的方法包括以下步骤：

用酶消化生物膜样品以形成消化的生物膜样品；

将所消化的生物膜样品分离成上清液和细胞沉淀物；

将细胞沉淀物与细胞裂解剂组合以释放内毒素并形成内毒素悬浮液；

将内毒素悬浮液浓缩成内毒素样品和悬浮液上清液；以及，

对内毒素样品进行细菌内毒素测试(BET)测定以获得样品内毒素值。

根据某些实施方案，生物膜由纤维素组成；优选地，生物膜基本上由细菌衍生的纳米纤维素(BNC)组成。根据本公开，生物膜至少部分地由产生内毒素的微生物(例如，革兰氏阴性细菌)组成。在优选的实施方案中，革兰氏阴性细菌来自葡糖醋杆菌属。