[发明专利]荧光PCR试剂冻干保护剂、冻干方法及应用

说明书

本发明公开了荧光PCR试剂冻干保护剂、冻干方法及应用，按质量百分含量计，所述冻干保护剂包括：海藻糖5‑15％，羟丙基‑β‑环糊精1‑10％，葡聚糖40 0.5‑5％，余量为水。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述荧光PCR试剂冻干保护剂不仅能够对荧光PCR试剂的冻干过程起到保护的作用，而且添加的保护剂成分简单，不影响荧光PCR的扩增反应；(2)所述冻干保护剂冻干后冻干球外观成型完整，冻干前后试剂性能变化小，冻干球稳定性好；(3)所述冻干保护剂简化了冷冻干燥程序，适应性较强，本冻干保护剂可适用于无甘油或低甘油含量的酶反应体系。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种冻干保护剂，具体为荧光PCR试剂冻干保护剂、冻干方法及应用。

背景技术

荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE(PerkinElmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能，其原理是：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加；每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

随着临床医学及生物诊断试剂的发展，为了满足临床需要，需要开发一种不需要低温保存及运输的荧光PCR扩增试剂。由于荧光PCR反应体系中含有活性酶、荧光探针等试剂，需要低温保存以避免其化学性质发生变化，因此需要采用冷冻干燥的方法。荧光PCR试剂冷冻干燥的主要方法步骤包括：

1、配液。将荧光PCR扩增缓冲液，引物，探针，酶等及冻干保护剂，按照配方进行混合配液，其中冻干保护剂的选择非常重要。常见的冻干保护剂包括糖、多元醇类、聚合物、表面活性剂类、氨基酸类、盐类等。一种可冻干的保护试剂通常不止含有一种保护剂，而是多种保护剂联用，然而冻干保护剂配方的摸索是一个耗时很长的过程，也是冻干成败的关键所在。

2、冻干。将上述可冻干反应试剂配制好，分装到PCR八连管或定制的PCR管中，然后放入冻干机，开始进行整个冻干过程。冷冻干燥程序通常分为三个不同的阶段：预冻阶段、一次干燥阶段和二次干燥阶段。预冻阶段一般在-50～-40℃的温度下保持2-3h，预冻完成后，保持冻干机内温度不变，开始抽真空至5-10pa保持10-20h。升华结束后，真空状态下将冻干机内部温度升至-35～-25℃并保持1-2h，然后真空状态下继续将冻干机内部温度升至-5～5℃保持1-2h。最后在真空状态下继续将冻干机内部温度升至25～35℃保持10-12h。冻干完毕后可充入氮气，再通过压塞的方式完成整个冻干操作。通过冻干方法制备的荧光PCR试剂可常温避光保存，性质稳定，运输方便，使用方便，使用时只需要添加溶解液或稀释液即可。

目前针对冻干保护剂的报道较多，如中国专利申请CN113025757A公开一种用于2019-nCov多重扩增反应试剂的冻干保护剂及其应用，所述冻干保护剂配方包括海藻糖、甘露醇、普鲁兰多糖、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂、水杨酸钠、硫酸软骨素、云芝多糖、透明质酸等十多种成分。另如中国专利申请CN112048545A公开一种冻干保护剂、PCR扩增试剂及其冻干方法和应用，所述冻干保护剂配方同样包括甘油、海藻糖、蔗糖、吐温-80、右旋糖酐-40、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸钠、抑菌剂、叔丁醇等十多种成分。以上冻干保护剂成份多样，组成复杂，且含有甘露醇、甘氨酸等，这些对后续PCR反应均有一定的抑制作用，可能会影响后续的检测。基于上述因素，开发一种成份简单，且对PCR没有明显抑制的冻干保护剂具有重要的意义。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种成分简单、对荧光PCR扩增影响较小，冻干程序适应性广的冻干保护剂，本发明提供了荧光PCR试剂冻干保护剂、冻干方法及应用。

技术方案：荧光PCR试剂冻干保护剂，按质量百分含量计，所述冻干保护剂包括：海藻糖5-15％，羟丙基-β-环糊精1-10％，葡聚糖40 0.5-5％，余量为水。