[发明专利]一种适应猪流行性腹泻病毒的Vero-E6悬浮细胞株sVero-E6及其应用

说明书

本发明公开了一种适应猪流行性腹泻病毒的Vero‑E6悬浮细胞株sVero‑E6及其应用，属于生物技术领域。其中本发明提供的sVero‑E6悬浮株能够稳定传代生长，利用其进行PEDV的培养时，培养的PEDV能够稳定增殖，并且可以用于连续增殖培养PEDV并多次收获病毒培养液，可以节约大量的生产成本和培养时间，提升产能。利用获得的病毒培养液制备得到的灭活疫苗免疫原性好，且稳定安全，能够有效用于预防猪流行性腹泻疾病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适应猪流行性腹泻病毒的Vero-E6悬浮细胞株(命名为sVero-E6悬浮株)及其应用，尤其涉及在培养猪流行性腹泻病毒以及生产猪流行性腹泻病毒灭活疫苗中的应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，并且各年龄段的猪对PEDV均易感，对养猪业造成严重的经济损失。

目前猪流行性腹泻病一般采取疫苗接种进行预防，国内多用Vero-E6细胞(非洲绿猴肾细胞)贴壁或悬浮培养增殖猪流行性腹泻病毒，以生产预防猪流行性腹泻疾病的相关疫苗。但传统贴壁培养在病毒扩大繁殖过程中需要利用细胞转瓶、细胞工厂，耗费较多的人力与财力。现有的悬浮培养方法中，例如专利文献CN107267443A(以下称文献1)公开一种适应全悬浮培养的Vero E6细胞株，但其在猪流行性腹泻病毒的接种前需要通过离心将细胞培养液更换为含1-2％新生牛血清的病毒培养维持培养液，操作繁琐，耗时耗力，且PEDV培养过程中需添加一定量的胰酶，含血清的病毒维持液会对胰酶作用产生影响。专利文献CN108866012A(以下称文献2)公开一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，但其需要使用片状载体悬浮培养，成本较高，并且在接种前需要对培养的Vero细胞进行洗涤，在接种时需要进行换液处理，工艺复杂，耗时耗力。

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种Vero-E6悬浮细胞株，命名为sVero-E6悬浮株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C202151，保藏日期为2021年1月29日。

在一些实施方式中，在用上述的sVero-E6悬浮株CCTCC NO：C202151培养猪流行性腹泻病毒收获的病毒培养液中，病毒的滴度可为6.00TCID₅₀/0.1ml以上，可选为6.50TCID₅₀/0.1ml以上，且sVero-E6细胞的活率可为70％以上，可选为73.24％-93.50％。

本发明另一方面提供一种利用sVero-E6悬浮株CCTCC NO：C202151培养猪流行性腹泻病毒的方法，其包括以下步骤：

S1：将sVero-E6悬浮株在营养液中扩大培养，获得细胞悬液；

S2：向步骤S1获得的细胞悬液中加入等体积的病毒维持液，随后加入EDTA-胰酶，并接种猪流行性腹泻病毒种毒，培养；

S3：收获病毒培养液。

在一些实施方式中，步骤S1中所述扩大培养为至细胞浓度为(4.0-6.0)×10⁶细胞/mL，细胞活率达95.0％以上。

在一些实施方式中，步骤S1中所述营养液为CD ST 258营养液。

在一些实施方式中，步骤S2中所述病毒维持液为DMEM和/或CD ST 239。

在一些实施方式中，步骤S2中所述EDTA-胰酶的加入量为使其终浓度为5-25μg/ml。

在一些实施方式中，步骤S2中所述猪流行性腹泻病毒种毒的接种量为1.0％-5.0％。