[发明专利]一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法

说明书

本发明提供了一种重组杆状病毒及其制备方法和应用，所述重组杆状病毒共表达三种目标基因，本发明还提供了利用该三种目标基因大幅度降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法。本发明采用制备的重组杆状病毒AcMNPV‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp感染sf9细胞，可以显著地降低sf9细胞的凋亡率，延长被感染sf9细胞的生活周期，增加目标蛋白的表达时间，提高基因表达的效率，更大限度地发挥杆状病毒‑昆虫细胞/幼虫生物反应器的应用价值。该方法通过对杆状病毒进行分子修饰，不需要额外人工添加化学合成药，安全性和时效性都得到极大地改善。

技术领域

本发明涉及一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法。

背景技术

昆虫杆状病毒多基因表达系统(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)是一种优秀的真核生物表达系统，因其具有较高表达效率和完善的蛋白质翻译修饰机制，被广泛的应用于生物、医药等领域。BEVS的主要原理是利用分子生物学技术，通过基因重组等方式构建出可同时携带多个目标基因的重组杆状病毒(如AcMNPV和BmNPV等)。重组杆状病毒再次感染昆虫细胞或昆虫幼虫的过程中，伴随病毒的增殖与复制，目标基因获得高效率表达，该系统兼具安全、高效等优点，目标蛋白生物活性高、易于浓缩纯化，是一种理想的生物反应器。

由于昆虫细胞或幼虫的特殊免疫机制，被感染的细胞会迅速启动细胞自毁程序，即细胞凋亡，以此来阻断子代病毒的增殖与复制。该现象无法最大限度的实现基因表达和细胞存活时间，严重制约了杆状病毒-昆虫细胞生物反应器的有效应用。目前，为解决上述问题，主要通过在细胞培养基中添加某些化学合成药物(如斑蝥素、去甲斑蝥素等等)，尽管该方法可在一定程度上降低昆虫细胞的凋亡率，但对药物添加浓度有着严格的限定，长期使用还存在细胞毒性、蛋白毒性等问题，安全性不高。此外，由于培养基中的药物不断消耗，此类化学合成药物需要不断人工添加，费时费力，无法做到持续的高效率抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种重组杆状病毒及其制备方法和应用，本发明还提供了一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法，该方法采用制备的重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp感染sf9细胞，可以显著地降低sf9细胞的凋亡率，延长被感染sf9细胞的生活周期，增加目标蛋白的表达时间，提高基因表达的效率，更大限度地发挥杆状病毒-昆虫细胞/幼虫生物反应器的应用价值。此外，通过对杆状病毒进行分子修饰，不需要额外人工添加化学合成药，安全性和时效性都得到极大地改善。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒含有细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3的编码序列，可同时表达iap1、iap2和iap3。

优选地，所述重组杆状病毒含有如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:11所示的序列。优选地，所述重组杆状病毒还含有如SEQ ID NO:12所示的序列。

本发明提供了一种重组杆状病毒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)以野生型BsNPV病毒基因组为模板，基因扩增获得细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3；

(2)将步骤(1)获得的细胞凋亡调控因子iap1、iap2、iap3和egfp共同连接到原始质粒pFBDM上，获得可同时表达iap1、iap2、iap3和egfp的重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp转至E.coli Sw106菌株，完成Tn7转座和基因重组，构建出E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp；