[发明专利]基于LAMP快速检测水稻白叶枯病病原菌的引物组及试剂盒

说明书

本发明公开了基于LAMP快速检测水稻白叶枯病病原菌的引物组，包括Xo1321LAMP引物组或Xo2967LAMP引物组，分别包括：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB。本发明还公开了试剂盒，至少包含Xo1321LAMP引物组或Xo2967LAMP引物组中的任意一组引物。本发明方法以水稻白叶枯病病原菌XOO基因为靶基因，设计并筛选获得能够特异性检测白叶枯病的LAMP引物组，特异性强；且灵敏度高，设备要求低，而且操作简便，耗时短，成本低，结果可视化，可实现在田间现场水稻病害快速诊断。

技术领域

本发明属于植物病原微生物检测技术领域，具体涉及基于LAMP快速检测水稻白叶枯病病原菌的引物组及试剂盒。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的作物之一，同时也是一半以上人口的主食(Fahad et al.,2014)。据2019年联合国粮农组织统计的数据，全球水稻年种植面积1.6亿公顷，年产量为7.5亿吨，其中90％以上来自亚洲国家(FAOSTAT)。在中国，有着悠久的种植历史，截至2020年统计数据，水稻的种植面积和产量仅次于玉米，是中国第二大粮食作物(中国统计年鉴2020年)。然而，水稻病害(包括细菌性、真菌性和病毒性)是限制水稻产量的重要因素之一，关于水稻病害胁迫在世界各地都有报道，特别是在亚洲，如中国、韩国和日本(SY Cho et al.,2013；Kim et al.,2011；Le et al.,2010；Yang et al.,2013)，这些病害可导致20-70％的产量损失(Fahad et al.,2014)。

水稻白叶枯病(Bacterial Leaf Blight，BLB)是由一种革兰氏阴性细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae(XOO)病原菌引起(Lee,Chung,Kang,Chung,Lee,2016)。病原体最初通过水孔和伤口进入植物，一旦进入维管系统，白叶枯病菌将产生不规则的黄色波浪边缘病变，浸泡直至堵塞木质部筛管，造成水稻苗期萎蔫，在后期可导致叶茎枯萎，最终导致产量下降(ShenRonald,2002；Zhang et al.,2020)

快速有效的水稻病害检测和防治是水稻保产的关键。目前，关于水稻病害检测方法：包括常规PCR诊断法(Song et al.,2014)，荧光免疫检测法(Awaludin et al.,2020)、抗原抗体检测法(Ding,Liu,Wu,Zhou,Ni,2014；Wang et al.,2006)、显微观察法(Deng,Li,Jian,Ji,Zhou,2013)、生物接种法((Li,Li,Dong,Wang,Zhou,2011))、qRT-PCR(Choet al.,2013；Xu et al.,2017)。虽然这些方法可以检测水稻病害，但也存在不足。例如，生物接种法费时费力，显微观察法对设备的依赖较高，且需要经过专门培训的人员。免疫学方法通常需要制备特异的抗体，周期往往较长。qRT-PCR虽然具有高灵敏度和高特异性，但检测设备昂贵，需要专业人员操作。

近年来，随着等温扩增技术发展，环介导的等温扩增(LAMP)以其灵敏度高、特异性强、速度快、设备要求低等优点在核酸诊断中得到广泛应用(Becherer,Borst,Bakheit,Frischmann,methods,2020)。LAMP在水稻病害检测中也有报道(Le et al.,2010；Zhou,Du,Fan,Zhou,2012)。使用LAMP检测水稻白叶枯病原菌，能在1小时内完成，灵敏度为10aM，但还需设计高特异性的LAMP检测引物，方能实现在田间现场对水稻病害的快速准确诊断。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供基于LAMP快速检测水稻白叶枯病病原菌的引物组及试剂盒，能够以水稻白叶枯病病原菌XOO基因为靶基因，设计并筛选获得能够特异性检测白叶枯病的LAMP引物组及快速检测试剂盒，灵敏度高，特异性强，操作简便，耗时短，成本低，可实现在田间现场水稻病害快速诊断。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：