[发明专利]一种磁珠法快速提取核酸的试剂及核酸提取方法

说明书

本发明提供了一种磁珠法快速提取核酸的试剂及核酸提取方法。具体地说，本发明提供了一种用于室温洗脱核酸的纳米磁珠及其制备方法，所述方法包括：将聚乙烯醇、硅酸钾、甘油、甲醇和水混合，再加入氯化亚铁四水合物、氯化铁六水合物和聚苯乙烯磺酸钠并混合；加入浓氨水溶液并加热反应；加入冰乙酸并反应；清洗得到纳米磁珠。本发明还提供了一种包含顺丁烯二酸、碘化钠、Brij 30、聚(乙二醇)‑聚(丙二醇)‑聚(乙二醇)三嵌段共聚物等的裂解结合液；包括纳米磁珠和/或裂解结合液配制试剂的试剂盒以及采用所述纳米磁珠、裂解液或试剂盒提取核酸的方法。本发明具有操作简单，不用挥发醇，无加热，上样量大，灵敏度高等优点。

技术领域

本发明涉核酸提取试剂领域，尤其涉及一种磁珠法快速提取核酸(尤其是病毒RNA)的试剂及核酸提取方法。

背景技术

核酸提取是核酸检测的第一步，提取产物的得率和质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。高纯度、高浓度的核酸样品是分子生物学实验过程中获得良好实验结果的重要条件之一。

核酸提取的传统方法包括酚氯仿抽提法、离心柱提取法、磁珠法等。磁珠法以超顺磁性纳米颗粒为载体，表面修饰相应的官能团与核酸分子特异性地识别和高效结合，可快速分离纯化核酸，提取过程无需离心或过滤，既可以手工操作，也可以使用自动化工作平台的形式完成，更能满足临床分子诊断对于某些检测灵敏度要求非常高的项目需求。

目前磁珠法提取也存在一些问题，例如对微量核酸提取效率不高，时间较长，提取纯度低，对后续核酸检测造成不利影响。尤其是鼻咽拭子这种样本，本身的病毒含量有限。

此外，其中病毒含量不高的covid-19在感染者身上潜伏期长，出现了很多无症状感染者，不易被发现，却可能传播病毒。推测的原因可能在于无症状感染者体内的病毒载量较低，常规的核酸提取或纯化过程的灵敏度有限，比如样本上样量少或在进行新冠初筛的十混一的纯度低、回收率差，导致其无法适应病毒载量较低的感染者的检出。

除此之外，目前市场上的基于磁珠法的商品化提取试剂盒提取过程一般需要加热步骤进行裂解孵育和核酸洗脱，而加热会对RNA产生一定程度的损伤，进而影响检测的灵敏度，同时现在实验室都通过大规模的核酸提取自动化筛查，样本的加热会引起气溶胶的污染和扩散，容易造成假阳性。

此外，目前市场上的主流的核酸提取试剂盒裂解液盒清洗液中都含有乙醇或者异丙醇，加热导致醇的挥发会影响提取效果的均一性，同时含高浓度的乙醇或异丙醇的试剂盒往往被认为含有易爆炸的试剂而不允许空运，同时也要保持在15-30℃的运输条件，在夏天即为炎热的环境中运输(40-60℃)往往会影响预装试剂盒中稳定性。

中国专利CN112501162A公开了一种用纳米磁珠提取新冠病毒RNA的试剂盒及提取方法，提高了核酸的产物和纯度，但其所述的裂解需要55-60℃加热10min，洗脱也需要在于55-60℃加热5min，而清洗液中含有高浓度的乙醇。

中国专利CN112458081A公开了一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，9min可以完成于血浆、血清、鼻咽拭子等样本病毒RNA的提取，但其裂解液和洗涤液含有高浓度的异丙醇或乙醇，裂解样本时加入体积为200μL，裂解和洗脱时需要55℃加热。

综上所述，现有技术中还没有能够提供一种上样量大(＞400μL)，全核酸提取过程裂解和洗脱无需加热，且所有核酸提取试剂组分不含有挥发醇的高灵敏度、快速磁珠法病毒RNA提取试剂，以满足现在大规模核酸筛查的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速磁珠法核酸提取试剂，本发明所提高的快速磁珠法核酸提取试剂操作简单，所有试剂组分不含有挥发醇(乙醇或异丙醇)，全过程无加热步骤避免了气溶胶污染，且可以增加上样量至400μL，具有极高的高灵敏度。

为了实现本发明的上述目的，本发明在第一方面提供了一种用于室温洗脱核酸的纳米磁珠(下文有时称为Mag PVA-Silica磁珠)的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：