[发明专利]一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法

权利要求书

1.一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，包括：

(1)将产乳酸菌株和产丁二酸菌株混合接种至培养基中，两种菌的比例为1:10～10:1，优选地1:5～5:1，更优选地1:1；

(2)好氧培养阶段：向培养基中补充烟酸和乙偶姻，使培养基含有终浓度为1～10mmol/L的烟酸和1～10mmol/L的乙偶姻；至菌株OD₆₀₀达到30～35，转入厌氧培养阶段；

(3)厌氧培养阶段：向培养基中补充甘氨酸和甘露醇，使培养基含有终浓度为1～10mmol/L的甘氨酸和1～10mmol/L的甘露醇；

其中，所述产乳酸菌株选自凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及其它通过基因工程手段改造可以用来生产L-和/或D-乳酸的菌株；所述产丁二酸菌株选自琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌以及其它通过基因工程手段改造可以用来生产丁二酸的菌株；

优选地，所述产乳酸菌株为CICC 23843或CGMCC No.11059，所述产丁二酸菌株为CICC23845。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基包含碳源，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、甘油、糖蜜、淀粉糖化液、秸秆糖化液中的一种或多种；和/或所述培养基包含氮源，所述氮源选自蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母浸粉、玉米粉、硫酸铵、尿素、硝酸钠和硝酸铵中的一种或多种；优选地，所述培养基包含：葡萄糖60g/L、玉米浆8g/L、硝酸钠8g/L、磷酸二氢钾5g/L、氯化钙0.1g/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(2)和步骤(3)中，pH5.0-7.5，优选6.5-7.0；优选地，通过加入氧化钙、氢氧化钙、碳酸钙、氨水、氢氧化钠中的一种或多种调节pH值。

4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述好氧培养阶段温度为25℃-60℃、优选35℃-55℃，溶氧为10％-70％、优选30％-60％，培养时间为3-10h、优选4-8h。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，进一步地，所述好氧培养阶段的转速为100-600rpm，通风量为0-3VVM，罐压为0.05-0.15MPa。

6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述厌氧培养阶段温度为30℃-60℃、优选45℃-55℃，培养时间为20-50h、优选20-40h，转速为200r/min以下，罐压为0-0.02MPa。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，在厌氧培养阶段，向发酵罐中补加600g/L的葡萄糖，使葡萄糖的浓度维持在20-30g/L。

8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，还包括回收好氧培养阶段产生的尾气，返回至厌氧培养阶段，尾气返回的通气量为0.1vvm-1.0vvm、优选0.1vvm-0.5vvm，每小时间歇通气时间0.1～0.5h、优选0.1～0.5h。

9.根据前述任一项权利要求所述的方法，包括：

(1)将产乳酸菌株和产丁二酸菌株混合接种至培养基中，两种菌的比例为1:5～5:1，优选地1:1；所述产乳酸菌株为CICC 23843或CGMCC No.11059，所述产丁二酸菌株为CICC23845；所述培养基的组成为：葡萄糖60g/L、玉米浆8g/L、硝酸钠8g/L、磷酸二氢钾5g/L、氯化钙0.1g/L，余量为水；

(2)好氧培养阶段：向培养基中补充烟酸和乙偶姻，使培养基含有终浓度为1mmol/L的烟酸和1mmol/L的乙偶姻；转速100-600rpm，通风量为0-3VVM，罐压0.05-0.15MPa，温度37℃，溶氧30％-60％，pH为6.5-7.0，至菌株OD₆₀₀达到30～35，转入厌氧培养阶段；

(3)厌氧培养阶段：向培养基中补充甘氨酸和甘露醇，使培养基含有终浓度为1mmol/L的甘氨酸和1mmol/L的甘露醇；转速为200r/min，罐压为0-0.02MPa，温度为45℃，维持pH为6.5-7.0，向发酵罐中补加600g/L的葡萄糖，使葡萄糖的浓度维持在20-30g/L之间；回收好氧培养阶段产生的尾气，返回至厌氧培养阶段，尾气返回的通气量为0.5vvm，每小时间歇通气时间为0.5h；当产酸速率下降到5g/L.h^-1以下时，停止补糖，待葡萄糖耗尽后，结束发酵。