[发明专利]一种利用种植窝洞骨屑提取人骨髓间充质干细胞的方法

说明书

一种利用种植窝洞骨屑提取人骨髓间充质干细胞的方法，无菌收集附于扩孔钻及攻丝钻壁内的种植窝洞骨屑，立即置于α‑MEM培养液中并封口；将离心管中的碎骨屑连同培养液在超净台内转移至培养皿中，置于恒温培养箱内孵育；3天后首次半量更换新鲜培养液，其后每3天全量换液，去除非贴壁细胞；待观察到长梭形细胞以骨屑为中心向周围爬出后更换为α‑MEM培养液继续培养；当细胞爬至皿底达80%密度时，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，1:3传代，记为P1，1:3传代至P3代，得到人骨髓间充质干细胞。

技术领域

本发明属于医学领域，具体涉及一种利用种植窝洞骨屑提取人骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞具自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节特性，被广泛应用组织缺损修复、免疫调节、基因治疗、药物筛选等领域的实验研究。间充质干细胞可以从多种组织中分离出来，如脐带、子宫内膜息肉、月经血、骨髓、脂肪组织等[Ding D-C, Shyu W-C,Lin S-Z. Mesenchymal Stem Cells [J]. Cell Transplantation, 2011, 20(1): 5-14.]。其中，骨髓来源的间充质干细胞分离简单，能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等多种细胞亚群[Sasaki H, Takeuchi I, Okada M, et al. Label-freemorphology-based prediction of multiple differentiation potentials of humanmesenchymal stem cells for early evaluation of intact cells [J]. PloS one,2014, 9(4): e93952.]。目前常用的人骨髓间充质分离方法包括贴壁法、密度梯度离心法、磁珠分选法等[Suliman S, Ali H, Karlsen T, et al. Impact of humanisedisolation and culture conditions on stemness and osteogenic potential of bonemarrow derived mesenchymal stromal cells [J]. Scientific reports, 2019, 9(1):16031.]。

现有技术提取人骨髓间充质干细胞的骨组织多来源于外科手术过程，如通过抽取人髂前上棘处骨髓进行分离培养、正颌手术中获取健康碎骨块进行组织块培养等。这些提取方法步骤繁琐，其中通过密度梯度离心法和贴壁法均涉及多次的过滤步骤和离心步骤，大大增加了污染的几率和细胞的损耗量，且离心后大量红细胞和干细胞混杂在一起，影响了干细胞的贴壁行为，可能降低原代细胞中干细胞的比例。此外，利用磁珠分选法提取的技术敏感性较高，个体操作差异对提取结果的影响较大。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对上述现有技术的不足，提供一种利用种植窝洞骨屑提取人骨髓间充质干细胞的方法，无需离心过程，主要利用干细胞的贴壁特性，通过定期换液逐渐纯化细胞。骨组织来源于种植手术过程中扩孔钻及攻丝钻壁内的健康牙槽骨，组织需求量小，获取难度低，无二次创伤，临床适应症广泛，并且可结合术者技术能力进行选择，大大降低了技术敏感性。该法所提取的骨髓间充质干细胞有望体外扩增后结合人工支架材料等促进颌骨缺损修复。

技术方案：种植窝洞骨屑在制备人骨髓间充质干细胞中的应用。

一种提取人骨髓间充质干细胞的方法，提取对象为种植窝洞骨屑。