[发明专利]一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法和一种基于该抗体的快速检测卡及其制备方法

说明书

本发明提供了一种NLS‑RARα单克隆抗体的制备方法和一种基于该抗体的快速检测卡及其制备方法。单克隆抗体的制备方法主要包括：确定靶向蛋白的免疫原、进行实验动物免疫、将免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合得到杂交瘤细胞、阳性克隆的筛选和大量制备单克隆抗体。然后再基于NLS‑RARα特异性单克隆抗体制作APL快速检测卡。本发明制备的单克隆抗体特异性好；基于NLS‑RARα单克隆抗体的APL快速检测卡，具有微创、方便、快速、经济的特点，可用于外周血检测，且不需要特殊设备，是现有诊疗技术所不具备的优势，且较现有技术更易推广。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法和一种基于该抗体的快速检测卡及其制备方法。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)在FAB分型中属M3亚型，是一种有特异染色体改变和融合基因的特殊类型急性白血病。APL在早期常发生严重出血及弥散性血管内凝血(DIC)，一直被认为是最凶险的急性白血病尽管应用全反式维甲酸和砷剂靶向诱导疗效可靠，但仍有15％的APL患者因诊断不及时而出现早期死亡。

目前，APL诊断主要依赖骨髓形态学、染色体检测、荧光原位杂交(FISH)、免疫分型和融合基因检测技术。骨髓形态学是直接肉眼镜检骨髓细胞形态来进行分型诊断，因细胞形态异质性和多形性，即使有经验的人员也常常与其他类型白血病混淆，给临床带来困扰甚至误诊。染色体检测和荧光原位杂交(FISH)可检测APL典型t(15；17)(q22；q21)染色体核型改变；免疫分型是利用流式细胞术检测APL细胞表面免疫标志CD33、CD13等；而融合基因检测是运用实时定量PCR(RQ-PCR)检测特征性白血病-维A酸受体α(PML-RARα)融合基因。这些技术较形态学更为客观、灵敏，但亦存在诸多局限性：①仪器设备昂贵(需流式细胞仪、免疫荧光显微镜等)；②检测周期长(需要数天)；③检测人员技术要求高；④经济成本高，患者负担重；⑤需要骨髓样本，不能检测外周血，不易取材，对患者创伤大。因此，探索可早期、快速、客观检测APL的新技术非常必要。

APL在遗传学上以t(15；17)(q22；q21)染色体异位和PML-RARα融合基因为特征，后者编码形成的PML-RARα融合蛋白是APL发生发展的关键。既往大部分研究都将PML-RARα融合蛋白作为一个整体，然而，本团队前期创新性发现，NE裂解PML-RARα融合蛋白生成的NLS-RARα蛋白是促进APL的发生发展另一关键指标，是早期诊断APL的新型诊断标志物。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法和基于该抗体的APL快速检测卡，该检测卡是基于NLS-RARα新型蛋白标志物为核心，通过制备NLS-RARα特异性单克隆抗体，进而结合免疫相关技术，研发用于APL的快速检测卡。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1、根据NLS-RARα靶蛋白序列选择和设计免疫原；

S2、用S1设计的免疫原进行实验动物免疫；

S3、将S2免疫后的实验动物的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；

S4、将S3中融合的杂交瘤细胞培养2-3周后，取培养液上清进行ELISA检测，初步筛选阳性克隆；

S5、采用免疫印迹方法进行验证与再次筛选，获得特异性好，抗体浓度高的阳性克隆；

S6、大量制备单克隆抗体。

作为本发明的优选实施方式，所述免疫原为COM-1a，所述COM-1a的序列为VQSVPGAHPVPV-C，所述COM-1a对应的抗体为1a，1a多肽针对PML-RARα的NE切割位点，可以特异性识别NLS-RARA特异性多肽。