[发明专利]一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法和一种基于该抗体的快速检测卡及其制备方法

权利要求书

1.一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、根据NLS-RARα靶蛋白序列选择和设计免疫原，所述免疫原为COM-1a，所述COM-1a的序列为VQSVPGAHPVPV-C，其中，C端表示序列方向的羧基端，所述COM-1a对应的抗体为1a，COM-1a多肽免疫原针对PML-RARα的NE切割位点设计，免疫产生特异性识别NLS-RARα的特异性抗体；

S2、用S1设计的免疫原进行实验动物免疫；

S3、将S2免疫后的实验动物的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；

S4、将S3中融合的杂交瘤细胞培养2-3周后，取培养液上清进行ELISA检测，初步筛选阳性克隆；

S5、采用免疫印迹方法进行验证与再次筛选，获得特异性好，抗体浓度高的阳性克隆；

S6、大量制备单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S2中动物免疫选择的动物为健康的新西兰大白兔。

3.根据权利要求1所述的一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S2中实验动物免疫的具体步骤为：选取健康的新西兰大白兔按常规实验兔注射免疫方法进行动物免疫，免疫注射共5针，注射免疫间隔3周、2周、2周、2周，免疫注射前COM-1a免疫原需要与佐剂1:1混合，充分乳化以保证免疫注射的效果。

4.根据权利要求1所述的一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S4中的ELISA检测所用的多肽有COM-1a和COM-1b，所述COM-1b的序列为VPGAHPVPVYA-C，其中，C端表示序列方向的羧基端，所述COM-1b对应的抗体为1b，1b没有特异性，COM-1b免疫原针对NLS-RARα和PML-RARα共同序列设计，其免疫产生的特异性抗体可同时识别NLS-RARα和PML-RARα。

5.根据权利要求1所述的一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S4中初步筛选阳性克隆的标准为：克隆体培养液上清同时与CQM-1a-BSA和CQM-1b-BSA蛋白反应，呈双阳性的克隆视为同时识别NLS-RARα和PML-RARα；只与CQM-1a-BSA蛋白反应呈阳性的克隆视为只识别NLS-RARα特异切割片段，即为筛选的目的克隆。

6.根据权利要求1所述的一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S5中筛选阳性克隆的标准为：将克隆体培养液上清分别与经慢病毒转染了NLS-RARα质粒的293T细胞和转染空载对照质粒的293T细胞的蛋白提取物进行免疫印迹验证，与转染了NLS-RARα质粒的293T细胞蛋白提取物反应而不与转染了空载的293T细胞蛋白提取物反应的克隆为理想克隆。

7.根据权利要求1所述的一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S6的具体步骤为：将S5中选取的阳性克隆，经细胞裂解后制备抗体mRNA模板，以所述模板进行RT-PCR反应得到抗体的重链和轻链cDNA，进行测序确认后构建到表达载体，构建好的抗体表达质粒转染细胞制备NLS-RARα重组单克隆抗体，经蛋白纯化柱纯化后的抗体即为单克隆抗体。