[发明专利]一种葡聚寡糖的制备方法

说明书

本发明公开了一种葡聚寡糖的制备方法，葡聚寡糖为β‑1,3‑葡聚寡糖，通过β‑葡聚糖酶一步水解可得然胶制备，所述的β‑葡聚糖酶序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过易错PCR筛选得到一种提高了活性的β‑葡聚糖酶突变体，其序列如SEQ ID NO.2所示。β‑葡聚糖酶突变体的水解率高于80%，水解产物聚合度为5‑7。本发明的方法具有效率高、反应温和、低能耗、低成本、无污染等有点，可实现β‑1,3‑葡聚寡糖的产业化制备。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，涉及一种葡聚寡糖的制备方法，特别设计一种生物酶法降解可得然胶制备β-1,3-葡聚寡糖。

背景技术

可得然胶是β-葡聚糖的一种，主要由微生物分泌而得。可得然胶由D-葡萄糖通过β-(1,3)-糖苷键连接而成，且无支链，分子量在4.4×10⁴～1×10⁵。可得然胶具有三股螺旋结构，不溶于水和乙醇等大多数的有机试剂，可在具有氢键破坏能力的溶液中溶解，比如pH＞12的强碱性溶液、甲酸、二甲基亚砜(DMSO)等。同时，它还具备加热后冷却凝胶的特性。此外，结合可得然胶粉末无色无味的特性，其常常作为食品添加剂被应用于食品工业中。相比之下，β-1,3-葡聚寡糖则存在较好的生物活性，比如诱导植物产生防御响应、免疫活性等。

目前，基于水解可得然胶制备β-1,3-葡聚寡糖的方法主要是酸水解。然而，酸水解效率较低，水解效率仅为25％左右，且产物聚合度跨度大；同时还造成环境污染等问题。生物法水解可得然胶制备β-1,3-葡聚寡糖是一种行之有效的、且绿色无污染的方法之一。研究表明，商业化的α-淀粉酶可水解可得然胶制备聚合度为1-9的β-1,3-葡聚寡糖，然而，水解产物宽泛的聚合度对于其后续的分离纯化，应用造成了较大的难度。因此，构建高效，窄聚合度的水解过程对于可得然胶来源的β-1,3-葡聚寡糖应用至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效酶解可得然胶制备窄聚合度的β-1,3-葡聚寡糖的方法。采用一种新的、可水解可得然胶的β-葡聚糖酶，经突变后，得到一种高效降解可得然胶的β-葡聚糖酶，其水解效率为80％-85％，β-1,3-葡聚寡糖聚合度为5-7。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种葡聚寡糖的制备方法，以可得然胶为原料，通过β-葡聚糖酶对其进行酶解制备葡聚寡糖。

所述的葡聚寡糖为β-1,3-葡聚寡糖，其聚合度为5-7。

所述的β-葡聚糖酶的反应条件为：1-8mL 1-30g/L可得然胶，1-4mL 1MPBS(pH5.0-7.0)，0.01-2mL 0.1-5g/Lβ-葡聚糖酶，添加去离子水至反应体系为10mL。反应液置于30-70℃水浴锅，反应1-24h。反应结束后测定水解率，为45％-50％。

进一步优选地，反应温度为20-40℃，更优选的，反应温度为40℃。

PBS溶液优选为pH 6.0；

进一步优选地，反应时间为1-12h。

所述的β-葡聚糖酶来源于Novosphingobium sp.P6W，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明以来源于Novosphingobium sp.P6W的β-葡聚糖酶为模版，对其序列进行非定向进化，获得一种新型重组β-葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。突变后反应更快，反应时间更短，水解效率更高。

所述β-葡聚糖酶的突变体(SEQ ID NO.2)是将SEQ ID NO.1所示的原始β-葡聚糖酶氨基酸序列第112位的脯氨酸置换为甘氨酸，第300位的亮氨酸置换为谷氨酸，第415位的异亮氨酸置换为酪氨酸。

一种β-葡聚糖酶的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。