[发明专利]杂交瘤细胞冻存液及其制备方法与应用

说明书

本发明属于细胞冻存技术领域，公开了一种杂交瘤细胞冻存液及其制备方法与应用。本发明杂交瘤细胞冻存液包含DMEM/F12培养基、二甲基亚砜、牛血清白蛋白)、谷氨酰胺、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1和表皮细胞生长因子。本发明杂交瘤细胞冻存液不含血清，化学成分明确，安全性高，解决了传统血清引入未知病原菌带来的潜在风险，所用添加剂成本低来源广，适用于杂交瘤细胞的冻存。用本发明冻存液保存的杂交瘤细胞，细胞复苏后存活率在85％以上，且细胞活性和功能不发生变化。

技术领域

本发明属于细胞培养和保存技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞冻存液及其制备方法与应用。

背景技术

细胞冻存，即使用现有的程序降温技术在-196℃的液氮中冷冻保存细胞，可使细胞暂时停止生长，并保留原有的细胞特性。此外，适度冻存一定数量的细胞可作为细胞种子使用，当细胞因操作或等其他原因发生污染，可使用冻存的细胞顺利的进行后续实验。

在进行细胞冻存的过程中需要加入适量的细胞冻存液，冻存液中的保护剂可减少冷冻过程中冰晶的形成降低细胞的损伤。同时，冻存液中含有细胞代谢所需的多种营养物质，能维持细胞的正常形态和生理功能。

传统的细胞冻存液使用90％胎牛血清(非渗透性保护剂)和10％DMSO(渗透性保护剂)混合配制而成，使用这种配制方式均需要添加大量的血清。一方面，血清的纯化方式和产品批次不易控制，成本较高。另一方面，动物来源的血清包含氨基酸，维生素，微量元素，无机盐离子和激素等成分复杂，还有许多未知的成分未被鉴定出来易造成潜在的危险(这是血清使用过程中的缺点，已被科研工作者所熟知)。因此，单克隆抗体的生产中，杂交瘤细胞的培养大多使用无血清培养基，基于此无血清且化学成分明确的冻存液越来越受研发人员的青睐。

发明内容

发明目的：针对当前杂交瘤细胞冻存的技术问题，本发明提供了一种无血清、成分明确、效果好的杂交瘤细胞冻存液，本发明还提供了该冻存液的制备方法和应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的杂交瘤细胞冻存液，包括无血清培养基、冻存保护剂、牛血清白蛋白(BSA)，还包括选自谷氨酰胺(L-Gln)、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、表皮细胞生长因子(EGF)中的一种或多种添加剂。

在一些技术方案中，所述无血清培养基包括但不限于RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、IMDM培养基，或以上培养基和F12培养基组成的组合中的一种或多种。

在一些技术方案中，所述无血清培养基选自DMEM/F12培养基、DMEM、MEM中的一种或多种。

在一些技术方案中，所述冻存保护剂为渗透性保护剂，包括但不限于DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、氨基酸或其组合，用于在细胞复苏时，促进细胞外水分进入胞内，以缓解渗透性肿胀引起的损伤。

在另一些技术方案中，所述冻存保护剂为非渗透性保护剂，包括但不限于蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白或其组合。非渗透性保护剂可以通过稀释降低胞外电解质的浓度，减少溶质损伤；还可以通过结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶的形成。

在另一些技术方案中，所述冻存保护剂为渗透性保护剂和非渗透性保护剂的组合。

在一些技术方案中，所述冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)。