[发明专利]KRAS基因突变多重检测引物探针及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种KRAS基因突变多重检测引物探针及其试剂盒包括上游引物，下游引物，G12位点野生型探针WP‑G12，G13位点野生型探针WP‑G13，检测KRAS基因2号外显子G12位点突变的突变型探针MP‑G12D、突变型探针MP‑G12C、突变型探针MP‑G12V、突变型探针MP‑G12S、突变型探针MP‑G12A、突变型探针MP‑G12R，检测KRAS基因2号外显子G13位点突变的突变型探针MP‑G13D。本发明的KRAS基因突变多重检测引物探针及其试剂盒快速高效，标准品的配制简单，检测体系的特异性与灵敏度高，游离DNA的利用率高，准确度高。

技术领域

本发明涉及一种KRAS基因突变检测产品，属于生物技术领域。

背景技术

在所有NSCLC的治疗预后生物标志物中，KRAS突变的特征是其高频率事件(接近腺癌的30％)，KRAS阴性预示着具有较好的预后，阳性突变患者缺乏有效的靶向治疗。KRAS基因突变存在于40％的结直肠腺癌中，是对抗表皮生长因子受体(抗anti-EGFR)9抗体无反应的预测标志物。美国国立综合癌症网络(NCCN)明确指出：所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态，并且不建议KRAS基因突变的非小细胞肺癌患者使用特罗凯进行分子靶向治疗。最近的临床前发现和早期试验表明，使用KRAS信号传导的下游靶向药物或直接靶向KRAS突变蛋白对治疗该类突变患者具有潜在的有效策略。循环肿瘤DNA(ctDNA)存在于晚期癌症患者的血浆中，ctDNA是结肠直肠癌(CRC)患者的预后标志物，也可用于预测对靶向治疗的反应，KRAS的突变表明那些患者将对特定治疗(西妥昔单抗、帕尼妥马抗)无效。

在细胞死亡后，肿瘤释放的DNA可以在血液和其他体液中检测到，如淋巴结、粪便和尿液中检测到。虽然ctDNA来自于存在体细胞突变，ctDNA与野生型DNA的比例可能低至1/10000，目前传统的突变检测方法无法对其准确的检测，通常超出了qPCR或dPCR方法的能力。对患者的血液样本(即液体活检)进行基因突变的评估有巨大优势。ctDNA的鉴定和定量可用于评估对治疗和监测疾病复发。此外，它可以提供突变状态的实时评估，而不必依赖于原发肿瘤的样本或需要转移部位的侵入性活检。使用ctDNA的能力也提高了在癌症成为临床可检测到之前进行筛查和早期诊断的可能性。目前在临床实践中使用的突变检测方法的中等灵敏度限制了ctDNA的检测。传统方法的敏感性阈值约为1％，但ctDNA可能只代表总循环DNA的一小部分。在早期癌症中，这个比例可能为0.01％。使用数字PCR(dPCR)来检测和定量KRAS致癌基因中7个最常见的突变，可是我们能更早期、更灵敏和准确的检测KRAS基因的突变情况，能很好的解决早期检测困难，并能无创实时检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速高效，检测体系的特异性与灵敏度高，游离DNA的利用率高，准确度高的KRAS基因突变多重检测引物探针，以及采用该引物探针的试剂盒。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种KRAS基因突变多重检测引物探针，包括上游引物，下游引物，G12位点野生型探针WP-G12，G13位点野生型探针WP-G13，检测KRAS基因2号外显子G12位点突变的突变型探针MP-G12D、突变型探针MP-G12C、突变型探针MP-G12V、突变型探针MP-G12S、突变型探针MP-G12A、突变型探针MP-G12R，检测KRAS基因2号外显子G13位点突变的突变型探针MP-G13D；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针WP-G12的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述野生型探针WP-G13的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；