[发明专利]抗河豚毒素抗体C31K8、制备方法及用途

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，提供了一种针对河豚毒素的人源化抗体C31K8及应用，该人源化抗体重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO.1‑2所示的氨基酸序列，通过亲和力分析本发明的抗体具有良好的亲和力，通过小动物实验证明，预先注射本发明抗体的抗体保护组小鼠在注射河豚毒素后，大部分小鼠不出现中毒症状，连续观察一个月无毒素致死情况，说明本发明的抗体具有优良的抗河豚毒素的作用，对河豚相关生物伤具有优良的预防或治疗作用，具备广阔的临床应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于抗河豚毒中毒的人源化抗体C31K8、其制备方法及在制备河豚毒素制剂方面的用途。

背景技术

河豚的鱼肉鮮嫩味美，带有肉刺的鱼皮胶质浓厚，食之黏口，味觉美感远胜于鱼翅、海参，因此被誉为“长江三鲜”之首。但河豚大都含有河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)，毒素集中于卵巢、肝脏、肾脏、血液、眼睛、鱼鳃及皮肤中。河豚毒素比较稳定，用盐腌、日晒、一般加热烧煮等方法都不易消除。

河豚毒素的化学研究始于1909年，1964年以后由Woodward测定了TTX的结构，1972年Kishi等采用化学方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子式为C₁₁H₁₇N₃O₈，分子量为319.27；分子主要由3个氮原子组成，它们与氢氧原子形成特殊的结构；其结构特征含有1个碳环，1个胍基，6个羟基，在C—5和C—10位有一个半醛糖内酯连接着分开的环。有专家将其称为“自然界最奇特的分子之一”，也是世界上最致命的毒药之一。1g河豚毒素的毒性是1g氰化物的1万倍。

为了解除河豚毒素，科学家试验了多种方法，抗体属于其中有效方式之一。由于抗体能够高效、特异地与体内和体外的各种抗原蛋白结合，使得抗体不仅能应用于调节免疫系统功能，还可以应用于各种高灵敏的检测方法。目前，抗体药物是生物技术药物最重要的组成部分，抗体试剂也是医学诊断和生物学研究中最常用到的试剂之一。因此，抗体相关的生物产品具有极高的应用前景和商业价值。抗体可以通过多种途径获得，对于毒素蛋白而言，抗体具有高度的中和性，是一种潜在的抗毒药物。

发明内容

本发明的目的在于，依托上述研究背景，研究抗河豚毒素人源化抗体C31K8、制备方法和用途，即提供了一种全新的人源化抗体、其制备方法和用途。

本发明的第一方面，提供了抗河豚毒素抗体C31K8，该人源化抗体重链可变区由FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4区组成，轻链可变区由FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4区组成。

人源化抗体重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

EVQLVESGGGLMKLWSKYKDLLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSARDDTASFWFHGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPVGGCDDRWLDYWGQGTLVTVSS

人源化抗体轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAFHPGVNYSWYQQKPGKAPKLLIYAAAHKPWQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCSIGNCCIHFGQGTKVEIK

关于人源化抗体的获得，先构建人源化抗体噬菌体展示文库，然后对人源化抗体进行筛选，并采用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆，经序列分析后得到人源化抗体，将人源化抗体在293系统中的表达及纯化后，获得高纯度的人源化抗体。

本发明的第二方面，提供了上述抗河豚毒素抗体C31K8的制备方法，包括以下步骤：

(A)根据抗体可变区基因全基因合成人源化抗体全长；