[发明专利]一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌、构建及其应用

说明书

本发明公开了一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇工程菌、构建及其应用，属于生物技术领域。通过表达异源角鲨烯氧化模块、提高MVA途径代谢通路和敲除羊毛甾醇竞争途径构建底盘酵母工程菌，在该底盘菌的基础上表达异源蛋白葫芦二烯醇合酶，构建得到生物合成葫芦二烯醇的酵母工程菌。本发明可以从头合成葫芦二烯醇，该方法不污染环境，且产量高、成本低，且无中间产物角鲨烯的纯在，为工业化生产葫芦二烯醇提供了依据。本发明最终生产葫芦二烯醇得产量可达到1432mg/L。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌、构建及其应用。

背景技术

葫芦二烯醇是从罗汉果、西瓜、冬瓜和苦瓜等多种葫芦科植物中分离得到的葫芦烷型四环三萜类化合物的基本前体，其在生物体内能被进一步被酶修饰形成罗汉果甜苷和葫芦素等化合物。葫芦二烯醇从植物中发现，传统的生产葫芦二烯醇的是通过植物提取，但容易受到植物生长的周期性与不稳定性等因素，并不利于工业化生产，且含量极低，根据现有报道从植物中提取的含量约为万分之一。除此，目前还报道了：葫芦二烯醇的生物合成前体物质在酿酒酵母中的主要合成途径是通过MVA途径合成，2分子的异戊二烯焦磷酸(IPP)分子和1分子的二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)经浓缩形成15个碳分子的法呢基焦磷酸(FPP)，2分子的FPP随后头对头耦合形成1分子的角鲨烯(Squalene,SQ)，角鲨烯随后被酵母自身的角鲨烯环氧化酶(ERG1)氧化生产2，3-环氧化角鲨烯，随后通过异源的葫芦二烯醇合酶(CBS)合成葫芦二烯醇。目前对于葫芦二烯醇生物合成的方法的优化往往是简单通过筛选不同来源的葫芦二烯醇合酶生产葫芦二烯醇，其虽然得到了相对较高的葫芦二烯醇产量，但是往往存在较多的中间产物角鲨烯，而过多的中间产物并不利于下游产业的分离纯化。

发明内容：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌、构建及其应用，该工程菌株可以将葡萄糖转化为葫芦二烯醇，产量较高，且无中间产物角鲨烯的存在，有利于葫芦二烯醇的大规模生成。

提供一种以葡萄糖为底物微生物合成葫芦二烯醇的工程菌的方法，包括以下步骤：

1)获得西葫芦籽来源的角鲨烯环氧化酶(cpSE2)替代酵母自身来源的ERG1，其催化角鲨烯生成2，3环氧角鲨烯的能力优于酵母自身ERG1；

2)利用酵母的自身同源重组系统在Gal7位点过表达角鲨烯环氧化酶cpSE2和角鲨烯合酶ERG9；

3)敲除羊毛甾醇合ERG7，并在该位点调控HMGS和截短HMGR的表达，获得产2，3-环氧角鲨烯的工程菌；

4)构建葫芦二烯醇合酶CDS表达质粒，将质粒导入步骤3)的工程菌中，得到产葫芦二烯醇的酵母工程菌。

按上述方案，步骤(1)为：采集西葫芦籽的RNA，经过反转录得到西葫芦籽来源的角鲨烯环氧化酶(cpSE2)。

按上述方案，所述角鲨烯环氧化酶基因cpSE2的核苷酸序列如SEQ ID NO.001中所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.002所示。该角鲨烯环氧化酶催化角鲨烯生成2，3环氧角鲨烯得活性比酿酒酵母自身来源的ERG1高50％。按上述方案，步骤(3)中截短HMGR指羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白截短了N端前400-551个氨基酸，优选截短羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白N端前500-551个氨基酸，更优选的范围为截短羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白N端前551个氨基酸。

按上述方案，步骤(4)具体为:通过使用高拷贝质粒pRS313过表达葫芦二烯醇合酶CDS生物合成模块，得到产葫芦二烯醇的酵母工程菌。

按上述方案，所述的酵母为酿酒酵母。

提供一种以葡萄糖为底物微生物合成葫芦二烯醇的工程菌株，酵母工程菌中整合了葫芦二烯醇合酶CDS基因和环角鲨烯氧化酶cpSE2基因。