[发明专利]一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌、构建及其应用

权利要求书

1.一种以葡萄糖为底物微生物合成葫芦二烯醇的工程菌，其特征在于：酵母工程菌中整合了葫芦二烯醇合酶CDS基因和角鲨烯环氧化酶cpSE2基因。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述的酵母工程菌上过表达角鲨烯环氧化酶cpSE2和角鲨烯合酶ERG9；

和/或所述酵母工程菌中敲除羊毛甾醇合酶ERG7位点，在该位点调控HMGS和截短HMGR的表达。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述截短HMGR指羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白N端截短了前400-551个氨基酸，优选截短羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白N端前500-551个氨基酸，更优选的范围为截短羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白N端前551个氨基酸。

4.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述葫芦二烯醇合酶CDS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.003所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.004所示。

5.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述角鲨烯环氧化酶基因cpSE2的核苷酸序列如SEQ ID NO.001中所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.002所示。

6.一种权利要求1所述的以葡萄糖为底物微生物合成葫芦二烯醇的工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)获得西葫芦籽来源的角鲨烯环氧化酶(cpSE2)替代酵母自身来源的ERG1，其催化角鲨烯生成2，3环氧角鲨烯的能力优于酵母自身ERG1；

2)利用酵母的自身同源重组系统在Gal7位点过表达角鲨烯环氧化酶cpSE2和角鲨烯合酶ERG9；

3)敲除羊毛甾醇合ERG7，并在该位点调控HMGS和截短HMGR的表达，获得产2，3-环氧角鲨烯的工程菌；

4)构建葫芦二烯醇合酶CDS表达质粒，将质粒导入步骤3)的工程菌中，得到产葫芦二烯醇的酵母工程菌。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)为：采集西葫芦籽的RNA，经过反转录得到西葫芦籽来源的角鲨烯环氧化酶(cpSE2)；

所述的酵母为酿酒酵母；

步骤(4)为:通过使用高拷贝质粒pRS313过表达葫芦二烯醇合酶CDS生物合成模块，得到产葫芦二烯醇的酵母工程菌。

8.权利要求1所述的工程菌在生物合成葫芦二烯醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的应用方法为：

将权利要求1所述的以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌培养，获得种子液；

将种子液接种到含有葡萄糖、氮源、金属元素和维生素的培养基中，分批流加补料发酵合成葫芦二烯醇；发酵过程中：分批补料葡萄糖控制葡萄糖浓度在10-15g/L。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的发酵温度为28-32℃，发酵时间为120h-144h，发酵过程中pH控制范围为4.5-5.5；溶氧量不高于40％，优选不高于20％。