[发明专利]病毒样颗粒及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种病毒样颗粒及其构建方法和应用，属于生物医学工程领域。本发明基于二代慢病毒载体系统，提供了一种包含冠状病毒属新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的Narm和NTD区域的慢病毒载体，同时通过改造psPAX2系统质粒，获得了具有更高RNA核载量的病毒样颗粒，且无病毒基因组整合风险，可以用于核酸检测质控品的制备、疫苗制备和基因治疗药物递送。

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种病毒样颗粒及其构建方法和应 用。

背景技术

基因治疗和病毒核酸诊断质控品领域使用的病毒类的载体主要包括：慢病毒、 逆转录病毒、腺病毒和AAV等。腺病毒的强免疫原性限制了其全身用药，AAV 的基因荷载量较小，也制约了其应用范围。相比而言，慢病毒载体从免疫原性和 基因荷载量方面有较强的优势。其中，慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人 类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒 载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体包含了包装、转染、 稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基 因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染 力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表 达。

冠状病毒为非节段单链(+)RNA病毒，基因组约29-31kb，是RNA病毒中 最长的RNA核酸链，具有正链RNA特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲 基化“帽子”，3’端有PolyA“尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似， 也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了 RNA-DNA-RNA的转录过程。

冠状病毒可分为四个属：α、β、γ、δ，其中β属冠状病毒又可分为四个独立 的亚群A、B、C和D群，其中，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)、MERS-CoV(引发中 东呼吸综合征)及2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)均属于该病毒属。

新冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60-220nm，含有四种结构蛋白：刺 突糖蛋白(S，Spike Protein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)； 小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(M， Membrane Protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜 的形成)；核衣壳蛋白(N，Nucleocapsid，主要作用是跟病毒的RNA结合)。 其中，核衣壳蛋白是病毒粒子的核心成分，它与病毒基因组RNA结合，将RNA 包装成核糖核蛋白(RNP)复合体。新型冠状病毒SARS-CoV-2N蛋白全长419 个氨基酸，由N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)以及连接两个结构域 及其两侧的三段无规则柔性区(IDR)构成。

专利CN202010172424.1公开了一种用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov 的假病毒标准品及其应用，该假病毒标准品是通过基因合成、质粒抽提和假病毒 包装等步骤制备而成，其中合成的基因包括新型冠状病毒2019-nCov基因RdRp、 Gene E和Gene N，所述的假病毒标准品具有较好的检测限、特异性、重复性等， 且无致病性，可再生，质控方法可靠，批次间稳定，可以长期稳定制备和供应。 专利CN202010750559.1则公开了一种新型冠状病毒核酸检测用假病毒标准物质 及其制备方法，将新型冠状病毒核酸整合至慢病毒表达质粒载体中，然后将构建 的慢病毒表达质粒与包装质粒共同转染至细胞中，经细胞表达后得到大量包装了 新型冠状病毒RNA的假病毒颗粒。其既有包装了病毒的部分RNA序列，又有包装了全部序列的假病毒标准物质，能完全模拟病毒RNA提取和核酸检测全过 程，可用于新型冠状病毒核酸定性和定量检测方法的验证评价以及实验室质量控 制。

然而，将慢病毒作为基因治疗载体，进行全身性给药以及作为病毒核酸诊断 质控品时，其整合性带来了一定的临床运用的安全风险。基于此，亟需开发一种 具有更高的RNA病毒荷载量，且无整合风险的病毒样颗粒。