[发明专利]一种核桃青皮多酚提取物降脂的潜在标志物及代谢通路的获得方法

权利要求书

1.一种核桃青皮多酚提取物降脂的肝脏潜在代谢标志物，其特征在于所述标志物被核桃青皮多酚提取物显著影响的从肝脏代谢物中筛选到18种潜在标志物，其中正离子模式下13种，负离子模式下5种，包括核黄素、pipecolic酸、酪氨酸、L-methionine、赖氨酸、L-leucine、次黄嘌呤、Glycerophosphocholine、谷胱甘肽、Gamma-Glu-Leu、胞嘧啶核苷、9 h-xanthine、R肉碱、UDP-glucose、眼酸、N-Acetylglutamic酸、葡萄糖6-phosphate、ADP；

所述标志物从高脂饮食诱导的高脂血症大鼠及核桃青皮多酚提取物干预后的肝脏代谢产物中获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出18个核桃青皮多酚提取物的潜在降脂标志物并进行鉴定；

通过MetPA分析两组差异代谢物的相关代谢通路，得到12条被核桃青皮多酚提取物干预后肝脏代谢通路，分别为D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，谷胱甘肽代谢，牛磺酸和次牛磺酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，戊糖和葡萄糖酸盐相互转化，丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢，烟酸和烟酰胺代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，色氨酸代谢，酪氨酸代谢，淀粉和蔗糖代谢。

2.一种获得权利要求1核桃青皮多酚提取物降脂的潜在标志物及代谢通路的方法，其特征在于所述方法由下列具体操作步骤实现：

（1）核桃青皮多酚提取物的制备

将核桃青皮晒干粉碎过80目筛，称取一定量核桃青皮粉末以液料比20:1加入50~70％乙醇回流提取80~100min，温度控制为50~60℃，提取2次，合并滤液，真空浓缩，冷冻干燥得到核桃青皮多酚提取物；

（2）高脂饲料制备

高脂饲料由重量份的基础饲料60~75份、蛋黄粉5~15份、猪油5~15份、胆固醇1~4份、猪胆盐0.6~1.0份、蔗糖5~15份、食盐0.1~0.3份，混匀，制备成型后于45~55℃烘干；

（3）动物模型的制备

健康雄性SD大鼠72只，体重130~150g，适应性喂养一周后，将大鼠随机分为2组：一组为模型组60只，另一组为正常对照组12只；正常对照组大鼠给予普通饲料喂养，模型组大鼠给予自制高脂饲料喂养，用以构建高脂血症大鼠模型；造模4周，随机抽取模型组和对照组大鼠各6只，采集血液，检测血液中的总胆固醇TC和甘油三酯TG，评判高脂血症大鼠模型造模是否成功，取造模成功的高脂血症大鼠，随机分为模型组，阳性药组和核桃青皮多酚提取物干预组；

（4）大鼠肝脏的采集和前处理

试验末期，大鼠禁食不禁水12h，用10%水合氯醛麻醉后解剖大鼠，迅速取出肝脏，用0.9%的生理盐水漂洗，去除血渍和污物，并剔除结缔组织和脂肪组织等，吸干，用无菌剪刀将样品分割成1g左右的小块，分装于无菌离心管，立即置液氮中速冻至少15min后置-80℃保存；取肝脏样品得到待测样本，利用UPLC/Q-TOF-MS技术检测肝脏代谢产物；

（5）LC-MS检测

色谱条件：仪器采用WatersACQUITYUPLC，使用ACQUITYUPLC®BEH C18 1.7µm（2.1×100mm）色谱柱，自动进样器温度4℃，以0.25mL/min的流速，40℃的柱温，进样10μL进行梯度洗脱，流动相为A相0.1%甲酸水和B相0.1%甲酸乙腈；梯度洗脱程序为0~1min，2%B相；1~9.5min，2~50%B相；9.5~14min，50~98%B相；14~15min，98%B相；15~15.5min，98~2%B相；15.5~17min，2% B相；质谱条件：仪器使用ThermoLTQOrbitrapXL电喷雾离子源ESI，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为4.80kV，负离子喷雾电压为4.50kV，鞘气45arb，辅助气15arb；毛细管温度325℃，毛细管电压35V/-15V，管透镜电压50V/-50V，以分辨率60000进行全扫描，扫描范围50~1000，并采用CID进行二级裂解，碰撞电压为30eV，同时采用动态排除（重复计数为2）去除无必要的MS/MS信息，动态排除时间设置为15s；

（6）数据预处理

通过Proteowizard软件将获得的原始数据转换成mzXML格式，利用R的XCMS程序包进行峰识别、峰过滤、峰对齐；主要参数有bw=5，ppm=15，peakwidth=c（10,120），mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method=centWave，得到包括质核比m/z和保留时间及峰面积等信息的数据矩阵；正离子模式获得4535个前体分子，负离子模式获得4188个前体分子，导出数据至excel进行后续分析；为使不同量级的数据能够进行比较，对数据进行峰面积的批次归一化；

（7）潜在生物标志物的筛选及通路分析

首先对样品数据采用自适换算（UV），然后进行多元统计分析。