[发明专利]一段核苷酸序列及其表达重组蛋白纳米颗粒在犬瘟热病毒疫苗的应用

说明书

本发明属于犬瘟热病毒蛋白疫苗开发领域，公开了一段核苷酸序列(ΔH)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。SEQ ID NO.1与相应载体基因连接，例如，铁蛋白基因(ΔF)，形成基因片段ΔH‑F，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。SEQ ID NO.2与原核蛋白表达载体系统重组后，表达可溶性rH‑F纳米颗粒，可应用于预防犬瘟热病毒的疫苗。

技术领域

本发明属于犬瘟热病毒蛋白疫苗开发领域，尤其涉及一段核苷酸序列、及其与载体基因重组表达蛋白纳米颗粒，以及在犬瘟热病毒疫苗的应用。

背景技术

目前，犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)，引起的一种接触式传染病，该病不受地区范围限制，在世界各地均有被发现。CDV的传统宿主主要包括一些食肉类动物，如：犬科、猫科、鼬科和浣熊科等。但是随着病毒自身的不断传播和进化以及商用疫苗的广泛应用，CDV已经在近几年感染至海豹、野猪以及非人类灵长类动物等野生动物的身上。感染CDV的初期临床表现主要为严重脱水、进食困难、精神低迷等状态。随着感染的持续加重，后期往往会伴随着痉挛和抽搐等病症。由于CDV展现出了极高的病死率，犬类在感染后，如果不接受合理且有效的治疗，病死率可达30％～80％，更有貂的感染致死率甚至达到100％。因此，CDV对于全球的无论是犬类养殖，毛皮动物经济，还是野生动物都是危害极为严重的传染病之一。鉴于犬瘟热治疗的局限性以及后期的不确定性，应对CDV最有效的方法依旧是在早期接种针对犬瘟热的疫苗以达到主动免疫，所以接种疫苗依旧是应对CDV最有效的方式。目前市面上销售的商用犬瘟热疫苗以减毒活疫苗的形式进行免疫，虽然能为所接种的动物提供针对目前存在的CDV野生毒株有效的保护，但仍然有大量的地区爆发犬瘟热的案例，其中不乏已经接种的动物，并且传播物种仍在不断扩大。考虑到犬瘟热的高致死率和强传播性，亟需一种高效、无害、易大规模制备的疫苗以及全新的免疫方式。

CDV基因组全长15690nt，是由6个非分段基因组成的负链RNA基因组，均含有开放阅读框，分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和聚合酶蛋白(L)。其中H蛋白是CDV致病的最关键蛋白，直接影响CDV的感染能力，也基于此对于H蛋白的亚单位疫苗是新型CDV疫苗的研究热点。H蛋白编码605个氨基酸，为囊膜表面Ⅱ型糖蛋白。H蛋白也是所有蛋白中分子量差异最大的蛋白，目前市面上最常用的Onderstepoort株减毒活疫苗的H蛋白分子量就偏低，与新分离出的野生毒株的H蛋白存在明显差异，这也使得对于传统减毒活疫苗所能提供的保护产生担忧。H蛋白的序列中单个氨基酸的突变或者是移码就有可能造成CDV进行跨物种传播。

铁蛋白(Ferritin)是一个含有24个亚基，大小为450kDa的储铁蛋白，因此它也广泛存在于所有细胞中。其主要作用是包裹在铁和一些磷酸盐外部形成铁核参与到血红蛋白的合成、体内酶的合成和一些代谢免疫等功能。

不同来源的铁蛋白虽然从一级结构来看差距很大，但其所组成的空间结构都是大致相同的，Ferritin所展现出的非常适合抗原呈递和免疫刺激的纳米颗粒的原因就在于它有着极强的组装能力，可以自发的组成为24聚体，以此形成高度重复和有序的对称结构。将目标抗原插入后并不影响Ferritin的自组装能力并且可以很好的将目标抗原展示在它的球体表面，从而可以更好的呈递目标抗原。此外自组装的Ferritin可以形成8个三重对称或者六个四重对称的亚基，这对天然构象为三聚体或者四聚体的抗原提呈也有着自身的优势。同时考虑到表位抗原序列过短，可能存在免疫原性差的特点，利用24聚体的形式进行免疫，在自身低免疫原性的同时可以更为有效的诱导针对抗原表位的免疫反应，提高疫苗的效力。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有的商用犬瘟热疫苗以减毒活疫苗的形式进行免疫，但仍有大量地区爆发犬瘟热的案例，其中不乏已经接种的动物，并且传播物种仍在不断扩大。

(2)目前市面上最常用的Onderstepoort株减毒活疫苗的H蛋白分子量偏低，与新分离出的野生毒株的H蛋白存在明显差异。