[发明专利]一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法

说明书

本发明提供了一种基于pCAG‑flox‑neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法，具体步骤如下：(1)将pCAG‑STOP2载体双酶切；将合成的片段经连接至pCAG‑STOP2载体；(2)将合成的载体再次酶切后连入polyA‑loxP得到pCAG‑flox‑neo载体；(3)将能够被sgRNA识别的猪pH11位点的sgRNA序列以及PAM序列插入到T3 promoter后，得到最终的基因敲入载体骨架pCAG‑floxP‑neo‑pH11；(4)将所需要的hKCNH2‑T618I及hmuPKD2片段通过PCR扩增，并通过一步克隆的方式插入到pCAG‑floxP‑neo‑pH11载体骨架中。本发明建立了一种高效、精准、操作简单同时可以敲除目的基因的方法，对于研究目的基因在哺乳动物或疾病模型中的作用具有重要科学意义。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其是涉及一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法。

背景技术

猪作为实验动物模型，不仅优于啮齿类动物，其在生理和解剖学方面与人类具有极高的相似性。基因修饰猪作为科研人员研究人类疾病的动物模型对生物医学的发展及改善人类健康具有重要的临床意义。然而，基因修饰猪的生产是一个漫长且低效的过程，严重阻碍了基因修饰猪模型的发展前景。

例如，利用IRES-IGF1-2A-Fat1定点整合实验中，双性状基因的阳性细胞克隆整合效率为2.3％(尤文妮.Rosa26位点双性状基因定点整合基因编辑猪的制备[D].吉林大学，2021.DOI:10.27162/d.cnki.gjlin.2021.006122)；

在对猪Mx1基因编辑的研究中，其作用效率不到30％(石超群.基于CRISPR/Cas9的猪Mx1基因编辑的研究[D].山东农业大学，2021.DOI:10.27277/d.cnki.gsdnu.2021.000473)；

在利用CRISPR/Cas9技术敲入猪pRSAD2基因的研究中，Rosa26-pRSAD2定点敲入的效率低于25％(Xie Z等，Generation of pRSAD2 gene knock-in pig via CRISPR/Cas9technology.Antiviral Res.2020Feb；174:104696)；

在Li等利用定点编辑猪基因组及克隆猪DNA异常甲基化等研究中，其质粒的工作效率仅达45％左右(Li G,Jia Q,Zhao J,Li X,Yu M,Samuel MS,Zhao S,Prather RS,LiC.Dysregulation of genome-wide gene expression and DNA methylation inabnormal cloned piglets.BMC Genomics.2014Sep 24；15(1):811)。

CRISPR/Cas9是通过RNA与DNA间的碱基互补配对进行结合，该类型的CRISPR系统具有一个核酸内切酶-Cas9，Cas9能够识别双链DNA并在独特的核酶区域使DNA双链断裂，这种双链的断裂现象会诱导细胞内产生两种修复机制，从而实现对切割位点的精准修复。CRISPR/Cas9系统在生成位点的特异性敲除/敲入迅速加快了该动物模型的临床应用，但是如何将该疾病模型传递给后代，成为科研人员亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法。本发明建立了一种高效、精准、操作简单同时可以敲除目的基因的方法，对于研究目的基因在哺乳动物或疾病模型中的作用具有重要科学意义。

本发明的技术方案如下：

一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法，具体步骤如下：