[发明专利]含有强启动子的用于链霉菌基因无痕编辑质粒

说明书

本发明涉及含有强启动子的用于链霉菌基因无痕编辑质粒，包括：强启动子Psco5768和密码子优化的毒素基因mazF，强启动子Psco5768控制密码子优化的毒素基因mazF的表达；强启动子Psco5768的序列包括SEQ ID NO:4所示的序列，密码子优化的毒素基因mazF的序列包括SEQ ID NO:3所示的序列。本发明构建的质粒选择了合适强度的启动子，并且可以用于链霉菌基因敲除、大片段敲除、定点突变、基因插入、大片段插入等多种编辑的高效无痕基因编辑质粒，为链霉菌来源的天然产物开发提供高效工具。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及含有强启动子的用于链霉菌基因无痕编辑质粒。

背景技术

启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。启动子可以通过增加或降低基因转录速率而影响基因的表达。因此，选择合适强度的启动子对基因的表达至关重要。

链霉菌是生物活性天然产物的主要来源，但相对低效的基因操作方法极大地阻碍了这些生物体天然产物的代谢工程。传统链霉菌基因敲除方法受抗性筛选标记的限制不能实现基因编辑的无痕操作，标记性基因的残留为进一步研究以及应用带来不可控的影响。因此，提供适合链霉菌的无痕基因操作的质粒尤为必要。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供含有强启动子的用于链霉菌基因无痕编辑质粒，利用强启动子Psco5768以及MazE-MazF细菌毒素-抗毒素系统构建了可用于链霉菌基因敲除、大片段敲除、定点突变、基因插入、大片段插入等多种编辑的高效无痕基因编辑质粒，为链霉菌来源的天然产物开发提供高效工具。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供含有强启动子的用于链霉菌基因无痕编辑质粒，包括：强启动子Psco5768和密码子优化的毒素基因mazF，强启动子Psco5768控制密码子优化的毒素基因mazF的表达；强启动子Psco5768的序列包括SEQ ID NO:4所示的序列，密码子优化的毒素基因mazF的序列包括SEQ ID NO:3所示的序列。

采用上述方案的有益效果：采用上述质粒可以用于链霉菌基因的无痕编辑。发明人在研究中意外的发现毒素基因mazF的表达在筛选过程中至关重要，启动子可以控制毒素基因mazF的表达，选用强启动子Psco5768，可以使毒素基因mazF的表达满足链霉菌的无痕编辑的需求，避免了因毒素基因表达不够导致的筛选效率低的问题。

进一步，还包括：诱导型启动子、密码子优化的抗毒素基因mazE、终止子和携带抗性基因的骨架；诱导型启动子诱导密码子优化的抗毒素基因mazE表达。

进一步，诱导型启动子为tfd-otrR-Ptor^*启动子，其序列包括SEQ ID NO:1所示的序列；密码子优化的抗毒素基因mazE的序列包括SEQ ID NO:2所示的序列；终止子的序列包括SEQ ID NO:5所示的序列。

进一步，质粒的序列包括SEQ ID NO:6所示的序列。

采用上述方案的有益效果：本发明所述质粒采用毒素-抗毒素mazEF系统改变表达调控方式，即由诱导型启动子诱导表达抗毒素MazE，组成型启动子持续表达毒素MazF，构建抗毒素开关调节的毒素反筛盒(toxin counter-selectation-cassette regulated by anantitoxin switch,TCRAS)。正常条件下添加诱导剂，抗毒素毒素MazE能够中和毒素MazF毒性；在反筛条件下，不加诱导剂，自由的MazF在RNA的ACA位点切割单链RNA，组织蛋白翻译，导致含有TARAS系统的细胞死亡，而经过同源重组删除的TARAS的细胞不受影响，正常生长，实现反筛。借助本发明的质粒可以实现链霉菌的基因无痕编辑操作。

本发明提供一种用于无痕编辑的菌株，包括上述的质粒。