[发明专利]含有强启动子的用于链霉菌基因无痕编辑质粒

权利要求书

1.含有强启动子的用于链霉菌基因无痕编辑质粒，其特征在于，包括：强启动子Psco5768和密码子优化的毒素基因mazF，强启动子Psco5768控制密码子优化的毒素基因mazF的表达；强启动子Psco5768的序列包括SEQ ID NO:4所示的序列，密码子优化的毒素基因mazF的序列包括SEQ ID NO:3所示的序列。

2.根据权利要求1所述质粒，其特征在于，还包括：诱导型启动子、密码子优化的抗毒素基因mazE、终止子和携带抗性基因的骨架；诱导型启动子诱导密码子优化的抗毒素基因mazE表达。

3.根据权利要求2所述质粒，其特征在于，诱导型启动子为tfd-otrR-Ptor^*启动子，其序列包括SEQ ID NO:1所示的序列；密码子优化的抗毒素基因mazE的序列包括SEQ ID NO:2所示的序列；终止子的序列包括SEQ ID NO:5所示的序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述质粒，其特征在于，质粒的序列包括SEQ ID NO:6所示的序列。

5.一种用于无痕编辑的菌株，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的质粒。

6.权利要求1-4任一项所述质粒或权利要求5所述菌株在链霉菌基因无痕编辑中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，基因无痕编辑包括基因或片段敲除、替换、插入或定点突变。

8.一种链霉菌基因无痕编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将同源臂连接到权利要求1-4任一项所述质粒，获得无痕基因编辑质粒，无痕基因编辑质粒含有安普霉素抗性基因Apr；

(2)将无痕基因编辑质粒转化大肠杆菌ETZ12567菌株，与链霉菌共培养，通过接合转移将质粒转移至链霉菌，并在含有安普霉素和诱导剂的平板上筛选转化子；

(3)转化子再培养和反向筛选正向筛选：将步骤(2)得到的转化子在含有诱导剂、不含安普霉素的培养基上进行培养，然后将细胞稀释涂布于不含安普霉素、不含诱导剂的平板上培养，只有发生二次重组，将TCRAS系统删除的细胞才会生长形成单菌落；

(4)将上一步的单菌落进行鉴定，得到目的菌株。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述同源臂为含有待基因编辑的靶序列区上游同源臂和下游同源臂的PCR片段。

10.一种含有强启动子的用于链霉菌基因无痕编辑质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：使用强启动子Psco5768组成型表达毒素蛋白基因mazF，利用氧四环素诱导型启动子诱导表达抗毒素蛋白基因mazE，将上述片段和PKC1139质粒经过酶切后，连接在一起，得到适合于链霉菌无痕基因编辑的遗传操作质粒pZY027。