[发明专利]HBB基因突变细胞及其应用

说明书

本发明涉及一种HBB基因突变细胞及其应用。该HBB基因突变细胞的制备方法包括以下步骤：使用RNP复合体靶向切割红系细胞的基因组DNA的HBB基因，RNP复合体包括Cas9蛋白与核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sgRNA；及使用含有HBB基因CD41‑42(‑CTTT)突变位点的单链核苷酸对上述靶向切割后的红系细胞的基因组DNA进行同源重组修复，制备HBB基因突变细胞。上述HBB基因突变细胞，能够在体外很好地模拟β‑地中海贫血病人的红细胞，作为一种地中海贫血细胞模型，为地中海贫血的基因治疗的研究提供理想的细胞研究工具，避免了伦理问题和对人体的创伤，且能长期稳定地在体外进行实验研究。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种HBB基因突变细胞及其应用。

背景技术

β-地中海贫血(β-thalassemia)是最常见的单基因遗传病，且分布范围广泛，全世界有1％～5％的人群携带地中海贫血变异基因。β-地中海贫血的主要致病机制是β-珠蛋白基因HBB突变导致β-珠蛋白链合成异常，β-珠蛋白表达量缺乏或严重减少，使α/β-珠蛋白链比率失衡，不能合成具有正常生物功能的血红蛋白四聚体，多余的α-链沉积在一起形成包涵体，破坏红细胞，造成功能性血红蛋白表达水平降低引起溶血性贫血。

β-地中海贫血一直是研究的重点，虽然其遗传学分子机制已经得到明确的探讨，但β-地中海贫血的治疗策略在很大程度上仍然只是降低临床症状的严重性，输血是重型地中海贫血患者最具代表性和常规的治疗方法之一，但长期输血会造成患者主要器官铁质沉积和损伤，需接受祛铁治疗，给患者带来沉重的生理负担和经济负担，且不能根治地中海贫血病。目前β-地中海贫血病唯一的治愈方法是同种异体造血干细胞移植(HSCT)，其成功与否取决于能否获得高度相容的人类白细胞抗原(HLA)匹配捐赠者的造血干细胞，然而找到匹配供体的几率小于30％，导致大多数患者治疗受限。

因此研究者们致力寻找β-地中海贫血的基因治疗方法，以使广大患者获得治愈的可能。在这些研究过程中，地中海贫血细胞模型的获取主要来源是地中海贫血患者的造血干细胞，即CD34⁺细胞，然而这种细胞的获取存在如下问题：涉及伦理问题；取样过程对人体造成创伤；且造血干细胞体外培养过程最长只能维持21天，不能进行长期的实验处理或实验观察，不是最理想的细胞研究工具。

发明内容

基于此，有必要提供一种HBB基因突变细胞，作为一种能够长期稳定地在体外进行研究的地中海贫血细胞模型，为地中海贫血的基因治疗的研究提供理想的细胞研究工具。

此外，还提供一种HBB基因突变细胞在鉴别和/或测试药物中的用途和一种制备HBB基因突变细胞的试剂盒。

一种HBB基因突变细胞，该HBB基因突变细胞的制备方法包括以下步骤：

使用RNP复合体靶向切割红系细胞的基因组DNA的HBB基因，RNP复合体包括Cas9蛋白与核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sgRNA；及

使用含有HBB基因CD41-42(-CTTT)突变位点的单链核苷酸对上述靶向切割后的红系细胞的基因组DNA进行同源重组修复，制备HBB基因突变细胞。

上述HBB基因突变细胞，能够在体外很好地模拟β-地中海贫血病人的红细胞，作为一种地中海贫血细胞模型，为地中海贫血的基因治疗的研究提供理想的细胞研究工具，避免了伦理问题和对人体的创伤，且能长期稳定地在体外进行实验研究。

在其中一个实施例中，上述单链核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在其中一个实施例中，Cas9蛋白与sgRNA的摩尔比为(2～3)：1。

在其中一个实施例中，RNP复合体和单链核苷酸通过电穿孔法转染进入红系细胞。