[发明专利]HBB基因突变细胞及其应用在审
| 申请号： | 202111547513.0 | 申请日： | 2021-12-16 |
| 公开（公告）号： | CN115011636A | 公开（公告）日： | 2022-09-06 |
| 发明（设计）人： | 孙筱放;杨影虹 | 申请（专利权）人： | 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心;广州柔济医院） |
| 主分类号： | C12N15/87 | 分类号： | C12N15/87;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/12;C12N15/10;C12N5/10;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 华进联合专利商标代理有限公司 44224 | 代理人： | 张灵莉 |
| 地址： | 510170 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | hbb 基因突变 细胞 及其 应用 | ||
1.一种HBB基因突变细胞，其特征在于，所述HBB基因突变细胞的制备方法包括以下步骤：
使用RNP复合体靶向切割红系细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括Cas9蛋白与核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sgRNA；及
使用含有HBB基因CD41-42(-CTTT)突变位点的单链核苷酸对所述靶向切割后的红系细胞的基因组DNA进行同源重组修复，制备HBB基因突变细胞。
2.根据权利要求1所述的HBB基因突变细胞，其特征在于，所述单链核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求2所述的HBB基因突变细胞，其特征在于，所述Cas9蛋白与sgRNA的摩尔比为(2～3)：1。
4.根据权利要求1～3任一项所述的HBB基因突变细胞，其特征在于，所述RNP复合体和所述单链核苷酸通过电穿孔法转染进入所述红系细胞。
5.根据权利要求4所述的HBB基因突变细胞，其特征在于，所述RNP复合体、所述单链核苷酸与所述红系细胞的比例为1nmol：(20nmol～100nmol)：(0.5×105个～2.5×105个)。
6.根据权利要求5所述的HBB基因突变细胞，其特征在于，所述电穿孔法采用的参数包括：电压1000V～1800V，方波脉冲宽度5ms～25ms，方波脉冲次数2次～4次。
7.根据权利要求1～3和5～6中任一项所述的HBB基因突变细胞，其特征在于，所述红系细胞为HUDEP-2细胞。
8.如权利要求1～7任一项所述的HBB基因突变细胞在鉴别和/或测试药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗β-地中海贫血和/或β-地中海贫血相关的并发症。
9.一种制备HBB基因突变细胞的试剂盒，其特征在于，包括Cas9蛋白、核苷酸序列如SEQID NO:1所示的sgRNA和含有HBB基因CD41-42(-CTTT)突变位点的单链核苷酸。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述单链核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
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