[发明专利]一种RPA-CRISPR/Cas12a-FQ系统及其在环境水体生物检测中的应用

权利要求书

1.一种RPA-CRISPR/Cas12a-FQ检测体系，其特征在于，用于检测环境水体中的目标生物，所述RPA-CRISPR/Cas12a-FQ检测体系包括Cas12a蛋白、单链DNA荧光探针、crRNA、扩增后的目标生物的目标DNA片段，所述目标DNA片段通过RPA等温扩增技术扩增目的基因组DNA而获得。

2.根据权利要求1所述的RPA-CRISPR/Cas12a-FQ检测体系，其特征在于：所述Cas12a蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中的任意一种；

所述单链DNA荧光探针的序列为TTATT，所述单链DNA荧光探针5’端和3’端分别带有一个荧光基团和一个荧光猝灭基团，所述荧光基团选自HEX、FAM、TAMRA中的任意一种，所述猝灭基团为IOWA或BHQ1；

所述crRNA选自crRNA1、crRNA2、crRNA3中的至少一种，所述crRNA1、crRNA2、crRNA3的序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

3.根据权利要求1所述的RPA-CRISPR/Cas12a-FQ检测体系，其特征在于：所述目标生物为微生物，所述微生物为金黄色葡萄球菌，所述目的基因组DNA为金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc，nuc基因的序列如SEQ ID NO.1所示，nuc基因扩增序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示，RPA扩增引物为nuc基因扩增引物，nuc基因扩增引物如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。

4.一种运用RPA-CRISPR/Cas12a-FQ系统检测环境水体目标生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、从待检测环境水体样本获得目标生物混合物，并从获得的目标生物混合物中获得目的基因组DNA；

B、以目标生物的目的基因组DNA为打靶位点，按照重组酶聚合酶扩增技术RPA的设计原则设计RPA扩增引物，并通过RPA等温扩增技术扩增目的基因组DNA，获得待检测高拷贝目的DNA片段；

C、按照crRNA的设计原则设计并合成目的基因的crRNA序列，设计并合成ssDNA荧光探针；

D、将步骤B中的目的DNA片段、步骤C中的crRNA和单链DNA荧光探针与Cas12a蛋白一起共同孵育，共同孵育后所得的混合物即为RPA-CRISPR/Cas12a-FQ系统，将RPA-CRISPR/Cas12a-FQ系统在荧光检测系统下观察拍照，获得检测结果。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述目标生物包括微生物、浮游生物以及可以用环境DNA进行检测的各类生物；

或者，所述目标生物为微生物，所述微生物为金黄色葡萄球菌，所述目的基因组DNA为金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc，nuc基因的序列如SEQ ID NO.1所示，nuc基因扩增序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述步骤B中，RPA扩增引物为nuc基因扩增引物，所述nuc基因扩增引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

所述步骤B中，RPA等温扩增反应过程包括：将Primer Free Rehydration buffer、Primermix、目的基因组DNA和ddH₂O混匀配制成RPA等温扩增体系，向RPA等温扩增体系中添加MgOAc并迅速混匀，放置于PCR仪中37℃孵育扩增20min，立刻85℃高温停止反应，获得的混合物即为扩增后的目的DNA片段。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤C中，去除CRISPR/Cas12a反式剪切体系中的PAM区的束缚，直接设计并合成目标生物基因的crRNA序列。