[发明专利]一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，涉及蛋白检测领域；包括以下组分：PtNPs/Cu‑TCPP(Fe)、DNA水凝胶、生物素修饰的适配体序列、cDNA、EXPAR等温扩增体系、Cas14a、crRNA和tracrRNA；该适配体序列为SEQ ID NO：1所示序列；该cDNA的序列为SEQ ID NO：2所示序列；该crRNA的序列为SEQ ID NO：4所示序列；该tracrRNA的序列为SEQ ID NO：5所示序列。本发明通过提供一种灵敏特异、操作简便、可靠通用的适配体传感检测方法，以实现对心肌梗死标志物肌酸激酶同工酶的高灵敏检测。

技术领域

本发明涉及蛋白检测领域，特别是涉及一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒。

背景技术

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是全球范围内引起死亡的常见病例。根据世卫组织统计，在2015年1790万死于心血管疾病的病例中，约有890万人死于缺血性心脏病，而急性心肌梗死是其主要病因，且呈年轻化趋势。因此对急性心肌梗死进行快速有效的诊断具有重要的临床意义。

检测体液中生物标志物的浓度是诊断急性心肌梗死的有效方法，具有较高的准确性和精密度。肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB，CK-MB)作为心脏生物标志物的一种，具有较高的特异性和敏感性，其连续监测还可用于判断再梗死的发生。急性心肌梗死发生时，血液中CK-MB浓度上升至正常值上限(20ng mL^-1，44kDa)的两倍以上。在心梗发生的第4-6小时，血液中CK-MB的含量开始上升，第24小时到达峰值，此时，其浓度可达正常值的10倍，在48-72小时恢复至正常水平。目前为止，已使用各种方法检测CK-MB，例如通过各种质量法、酶联免疫吸附实验(ELISA)、高效液相色谱等来实现。虽然这些方法是有效和强大的，但他们在简化分析程序、降低成本和提高检测灵敏度方面仍然具有挑战性。因此，仍迫切需要一种高灵敏度、高特异性、操作简便、低成本的CK-MB检测方法，并改善更宽的动态范围以覆盖临床症状。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过提供一种灵敏特异、操作简便、可靠通用的适配体传感检测方法，以实现对心肌梗死标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)的高灵敏检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：PtNPs/Cu-TCPP(Fe)、DNA水凝胶、生物素修饰的适配体序列、cDNA、EXPAR等温扩增体系、Cas14a、crRNA和tracrRNA；

所述适配体序列为SEQ ID NO：1所示序列；所述cDNA的序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述crRNA的序列为SEQ ID NO：4所示序列；所述tracrRNA的序列为SEQ ID NO：5所示序列；

所述PtNPs/Cu-TCPP(Fe)的制备方法包括：以Cu(NO₃)₂·3H₂O、三氟乙酸、PVP、TCPP(Fe)为原料，二甲基甲酰胺和乙醇为溶剂，经过超声和加热反应得到纳米片，所述纳米片再分散在含有K₂PtCl₄和柠檬酸钠的水溶液中用卤素灯照射，得到所述PtNPs/Cu-TCPP(Fe)；

所述DNA水凝胶的合成方法包括：首先分别将丙烯酰胺与S1和S2混合，通过聚合反应制备得到线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物PS1和PS2；然后制备包覆所述PtNPs/Cu-TCPP(Fe)、所述PS1、所述PS2和Linker的DNA水凝胶；所述S1的序列为SEQ ID NO：6所示序列；所述S2的序列为SEQ ID NO：7所示序列；所述Linker的序列为SEQ ID NO：8所示序列。