[发明专利]一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒有效
| 申请号： | 202111543727.0 | 申请日： | 2021-12-16 |
| 公开（公告）号： | CN114236124B | 公开（公告）日： | 2023-06-09 |
| 发明（设计）人： | 王瑜;高志贤;韩铁;周焕英;彭媛;李双;韩殿鹏;任舒悦;秦康;陈梦梦 | 申请（专利权）人： | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 |
| 主分类号： | G01N33/573 | 分类号： | G01N33/573;C12Q1/6883;C12Q1/6844;C12N15/115;C12N15/113 |
| 代理公司： | 北京东方盛凡知识产权代理有限公司 11562 | 代理人： | 程小芳 |
| 地址： | 300050*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 等温 扩增 cas14a 双重 放大 检测 肌酸激酶 试剂盒 | ||
1.一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：PtNPs/Cu-TCPP(Fe)、DNA水凝胶、生物素修饰的适配体序列、cDNA、EXPAR等温扩增体系、Cas14a、crRNA和tracrRNA；
所述适配体序列为SEQ ID NO：1所示序列；所述cDNA的序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述crRNA的序列为SEQ ID NO：4所示序列；所述tracrRNA的序列为SEQ ID NO：5所示序列；
所述PtNPs/Cu-TCPP(Fe)的制备方法包括：以Cu(NO3)2·3H2O、三氟乙酸、PVP、TCPP(Fe)为原料，二甲基甲酰胺和乙醇为溶剂，经过超声和加热反应得到纳米片，所述纳米片再分散在含有K2PtCl4和柠檬酸钠的水溶液中，用卤素灯照射，得到所述PtNPs/Cu-TCPP(Fe)；
所述DNA水凝胶的合成方法包括：首先分别将丙烯酰胺与S1和S2混合，通过聚合反应制备得到线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物PS1和PS2；然后制备包覆所述PtNPs/Cu-TCPP(Fe)、所述PS1、所述PS2和Linker的DNA水凝胶；所述S1的序列为SEQ ID NO：6所示序列；所述S2的序列为SEQ ID NO：7所示序列；所述Linker的序列为SEQ ID NO：8所示序列。
2.根据权利要求1所述的基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于，所述超声的时间为15min。
3.根据权利要求1所述的基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于，所述卤素灯照射具体为用卤素灯在120W的条件下照射2h。
4.根据权利要求1所述的基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于，制备包覆所述PtNPs/Cu-TCPP(Fe)、所述PS1、所述PS2和Linker的DNA水凝胶的具体操作为将所述PtNPs/Cu-TCPP(Fe)、所述PS1、所述PS2和所述Linker混合后，在65℃和1000rpm条件下孵育20分钟。
5.根据权利要求1所述的基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于，所述EXPAR等温扩增体系的组分分为A部分和B部分，所述A部分包括：Nt.BstNBI切口酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、1×Thermopol缓冲液和0.5×SYBR Green I；所述B部分包括：EXPAR模板、dNTP混合物、0.5×NEBuffer 3.1和竞争解离出的cDNA；所述竞争解离出的cDNA的获得方法包括：将链霉亲和素修饰的磁珠用PBS重悬，加入所述生物素修饰的适配体序列孵育结合，然后加入互补的cDNA和目标物进行竞争，通过磁分离获得所述竞争解离出的cDNA。
6.根据权利要求5所述的基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于，所述EXPAR模板的序列为SEQ ID NO：3所示序列。
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