[发明专利]一种羟基改性蛋白质芯片的制备方法

说明书

本发明提供了一种羟基改性蛋白质芯片的制备方法，本发明属于蛋白质芯片的制备技术领域，本发明提供的蛋白质芯片以玻璃载玻片为主要原料，利用预先配制的刻蚀液在载玻片上进行周期阵列刻蚀；以环硅氧烷和环氧化物为聚合原料，利用辐射聚合的方式使得聚合原料与载玻片之间形成了共价连接，得到蛋白质芯片基质；利用蛋白质芯片基质在生理条件下对蛋白质进行吸附，蛋白质芯片基质具有两种不同的区域，经刻蚀并辐射聚合后的区域不仅为蛋白质提供良好的水相环境，还能与蛋白质表面的基团发生氢键等弱相互作用，而未处理区域则表现为疏水，因此反差巨大，使得制备的蛋白质芯片的信噪比高，灵敏度也很高。

技术领域

本发明是一种羟基改性蛋白质芯片的制备方法。属于蛋白质芯片的制备技术领域。

背景技术

根据蛋白芯片用途的不同，使用不同的蛋白固定方法。一般的蛋白固定方法包括：被动吸附、共价偶联、亲和结合。其中被动吸附(passive adsorption)是制备蛋白芯片最简单的方法：将蛋白直接点样到疏水或荷电介质表面，蛋白将被吸附在介质表面。

Lueking等用点样机器人将蛋白溶液高密度点样到PVDF滤膜上，可以在滤膜上检测到特定的蛋白，且具有较高的灵敏度且具有较高的灵敏度。在分析自身免疫病人的血清进行自身抗体定量分析的过程中，Joos等人利用硝酸纤维素膜、多聚赖氨酸包被的载玻片制做芯片。另外，也可以将硝酸纤维素膜放在载玻片上以便进行芯片的制备及后续的检测分析。

聚赖氨酸修饰玻片虽然不是通过共价键固定蛋白质的，但由于聚赖氨酸修饰玻片广泛地作为基因芯片的载体，且制作简单，具有较高的信躁比以及较均一的点样形态等优点，仍有许多蛋白质微阵以聚赖氨酸修饰玻片作为载体。Angenendt等通过比较多种载体以及其表面修饰方法发现，聚赖氨酸修饰的玻片上点样点的形态比较均一，点间变异系数(11％)小于其他载体。但是聚赖氨酸修饰玻片同其他二维载体表面一样，敏感度不佳，最低检测限较高。Haab等报道了用聚赖氨酸修饰的玻片为载体的抗体微阵列来研究抗原抗体的相互作用，但在玻片表面固定抗体时拖尾现象很明显，而且在点的内部抗体的分布也是不均匀的，影响结果的正确性和精确性。

聚丙烯酰胺凝胶(3-dimensional polyacrylamide gel)是一种三维表面的介质，与二维表面相比，可以提供更高的灵敏度、动态范围和天然构想。它是基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。丙烯酰胺凝胶聚合后，可以将成型的胶置于载玻片表面，Miller等人将184个抗体点样到水凝胶包被的载玻片和多聚L赖氨酸包被的载玻片上(with a cross-linkinglayer)，水凝胶表面的的信噪比更高。

被动吸附适于进行灵敏的蛋白质表达及抗体特异性的筛选，但是由于蛋白是随机吸附到介质表面的，蛋白会有部分的变性，无法进行定量分析，蛋白结合到基质上的方向也很难控制。不同蛋白质的吸附能力不同信躁比也较低质的吸附能力不同，信躁比也较低。由于某些吸附能力较弱，洗脱过程中一些蛋白质有可能脱落。由于蛋白质在基质表面固定的部位及方向不同，其生物活性将有所差别，使实验的重复性不好。

为了解决上述被动吸附方法产生的问题，我们采用先设计阵列的方式，首先对载玻片进行刻蚀处理，辐射聚合的原料之一——环硅氧烷的聚合产物聚硅氧烷具有良好生物相容性与保湿性，因此能够为蛋白提供良好的亲水环境；而另一个原料——环氧化物经辐射聚合后形成大量的羟基，这就形成了具有亲附蛋白特性的点阵列。利用点阵列的吸附特性，使得点阵列对蛋白的吸附过程既点样过程，使得待吸附蛋白在生理环境下进行吸附，大大降低了变性的可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种羟基改性蛋白质芯片的制备方法。其基底为载玻片，本身具有疏水性质，而辐射聚合的点阵列具有良好的亲水特性，这就与基底形成了强烈的反差，从而大大增加了信噪比。聚硅氧烷以及环氧化物引入的羟基提供了大量的亲水基团，具有良好生物相容性与保湿性，为吸附蛋白保持良好的生理活性提供了保证；引入的羟基能够与蛋白质表面的基团产生氢键等若相互作用，从而提高基质与蛋白质的吸附力。