[发明专利]一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，包括以下步骤：S1、设计与合成带标签的扩增引物：引物的5’端带有标签序列，并且5’端磷酸化修饰，引物的3’端为扩增子的特异性引物，并经HPLC纯化；S2、点样仪以含有5184个微孔的芯片作为载体，根据不同通量组合，完成芯片制备，进行PCR扩增，芯片中的扩增产物混合收集至离心管；S3、扩增产物进行纯化，末端修复和加A反应等，文库上机测序。基于此方法得到测序结果显示，与常规建库方法得到的物种组成结构和丰度高度一致。本技术发明大大地简化了实验操作流程，具有基因文库构建的高通量优势，提高了建库效率，缩短了实验周期，减少了试剂耗材等成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法。

背景技术

16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。通过检测16S rDNA可变区的序列变异和丰度，可了解环境样品中群落多样性信息，在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起着重要的作用。近些年来，基于二代测序的16S rDNA检测大大加速了人们对微生物群落的了解。但由于二代测序的读长限制，目前微生物多样性研究仅检测16S rDNA的某段或某几段高变区，物种分类也只能精确到属水平。无法将其准确注释到物种水平。Sanger测序虽能接近全长，但通量低，且成本高，不适用群体复杂的环境微生物宏样本。随着三代SMRT测序技术的出现，PacBio全长16S rDNA测序集合了Sanger测序的读长优势和二代测序的高通量优势，具有和二代测序相媲美的准确度和重复性，可提供更准确的物种分类和更多的物种鉴定，在系统发育、群落鉴定和代谢通路预测方面都更有优势。

常规的PacBio全长16S rDNA基因的文库构建是通过带有标签序列的PCR引物扩增16S全长基因，然后每个扩增产物需采用AMPure磁珠纯化，进行Qubit浓度测定，确定PCR产物的浓度与总量。从而等量混合，混合样本再经过DNA损伤修复，末端修复加A，再与测序接头相连接，获得基于PacBio测序平台的全长扩增子文库。这种方法对于少量样本而言，操作简便，测序结果较好，价格偏低。随着微生物研究的逐渐深入以及测序价格的降低，目前出现了很多基于大量样本的微生物群落研究。常规的16S rDNA的文库构建方法对于大量样本而言，建库过程繁琐，周期长，成本相对较高。

因此，需要一种高通量、低成本、速度快、质量好的基因文库构建技术方法来解决以上问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，解决了常规的16S rDNA的文库构建方法对于大量样本而言，建库过程繁琐，周期长，成本相对较高的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，包括以下步骤：

S1、设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5’端带有标签序列，并且5’端磷酸化修饰，每对引物的3’端为扩增子的特异性引物，引物采用HPLC纯化；

S2、扩增子样本的扩增：

S2.1、配置反应液：取一个经过灭菌并烘干的384孔板，在孔内配置芯片制备的反应液；

S2.2、设置仪器：将MSDN点样仪的模式选为384×12模式，喷液体积为100nl。其中384代表384个样本，12代表12次重复，即每个384孔板的孔内试剂会喷入芯片的12个孔中，每个芯片孔反应体系为100nl；