[发明专利]重组载体及其构建方法和应用

说明书

本申请涉及一种重组载体及其构建方法和应用。该重组载体的构建方法包括如下步骤：构建带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒；向带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段，sgRNA片段用于敲除vGAT，得到重组载体。上述重组载体的构建方法将CRISPR基因编辑技术和化学遗传激活技术结合，得到重组载体能够用于敲除GABA能神经元的vGAT，并通过能化学遗传学激活敲除vGAT的GABA能神经元，达到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组载体及其构建方法和应用。

背景技术

目前，主要采用光遗传学对特定的细胞进行激活，具有以下局限性：①有创性。光遗传学需要埋置光纤陶瓷插芯，是一个有创性手术。②活动范围的局限性。若采用有线光遗传激活，需要将光纤与陶瓷插芯链接，这会限制小鼠的活动范围；若采用无线光遗传激活，需要用线圈布置一个磁场，为了保证磁场的强度，小鼠能活动的范围也是有限的。③光热效应对细胞的损伤。光遗传学刺激通常采用蓝光，蓝光的光热效应较强，长时间或者多次激活，可能对光纤尖端的神经元造成损伤。④适用场景的局限性。正由于前面②和③提到的活动范围的局限性和光热效应对细胞的损伤，该技术适用的场景有限，需要长时间或者在复杂环境中对小鼠的特定神经元进行操纵时，该技术不再适用。

发明内容

基于此，有必提供一种重组载体及其构建方法和应用。

一种重组载体的构建方法，包括如下步骤：

构建带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒；及

向所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒中插入sgRNA片段，所述sgRNA片段用于敲除vGAT，得到所述重组载体。

上述重组载体的构建方法将CRISPR基因编辑技术和化学遗传激活技术结合，得到重组载体能够用于敲除GABA能神经元的vGAT，阻断GABA释放，并通过能化学遗传学激活敲除vGAT的GABA能神经元，便于对特定神经元进行长时间激活，达到长时程激活敲除vGAT的GABA能神经元的目的，化学遗传学激活技术是仅通过注射或口服相应的激活药物，无需进行有创手术，具有无创性，提高了动物的适应性，且不再需要通过光纤连接LED给予光刺激，减少了实验过程中的实验装置使用，提高了便利性，也不再需要与光纤连接或者在特定范围的磁场中运动，小鼠的活动范围更加广泛；避免了光热效应带来的细胞损伤，可以长时间对特定神经元进行激活处理，适用范围更广泛。

在其中一个实施例中，构建所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒的步骤包括：

采用质粒重组技术将原始sgRNA骨架质粒与化学遗传学质粒进行质粒重组，所述化学遗传学质粒带有所述化学遗传学激活元件。

在其中一个实施例中，构建所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒的步骤包括：

将所述原始sgRNA骨架质粒进行酶切，得到含有sgRNA骨架的片段；

将所述化学遗传学质粒进行酶切，得到含有所述化学遗传学激活元件的片段；及

将所述含有sgRNA骨架的片段和所述含有所述化学遗传学激活元件的片段连接，得到所述带有化学遗传学激活元件的sgRNA骨架质粒。

在其中一个实施例中，所述原始sgRNA骨架质粒包括AAV-U6-sgRNA(backbone)-pCBh-DIO-ChR2-mCherry质粒；所述化学遗传学质粒包括pAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry质粒；

所述将原始sgRNA骨架质粒与化学遗传学质粒进行质粒重组的步骤包括：