[发明专利]一种减毒、复制可控的顺向HSV示踪系统及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了减毒、复制可控的顺向HSV示踪系统及其构建方法和应用。具体公开了跨神经突触的重组1型单纯疱疹病毒，其通过将H129株基因组中神经毒力因子编码基因γ34.5两个拷贝基因敲除；然后将表达可控的γ34.5自降解重组基因回补进γ34.5原来基因位点得到；表达可控的γ34.5自降解重组基因中包含敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST。本发明提供的单纯疱疹病毒可作为目的基因长效高表达的基因转导载体、神经环路长时程、顺行跨多级突触结构示踪、功能神经环路解析等；并在神经系统靶向基因治疗、溶瘤病毒治疗、病毒复制与致病机理分析、动物感染模型建立等方面具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及神经生物学及分子病毒学，具体涉及单纯疱疹病毒示踪系统的减毒改造，利用本发明提供的减毒型重组单纯疱疹病毒可用于神经环路标记、基因转导、溶瘤治疗、动物感染模型建立、病毒复制与致病机理的分析、抗病毒药物筛选等方面。

背景技术

病毒跨突触示踪技术在近年来神经回路解析中得到了越来越广泛的应用。传统的神经网络示踪方法，如染料、化合物示踪剂、蛋白肽类等，能沿轴突转运但因不能跨突触，只能标记局部神经元形态。相对嗜神经病毒作为示踪工具有明显优势：1)高效感染神经细胞；2)能跨突触传播；3)跨突触方向可控，可特异逆向或顺向传播；4)病毒跨突触后能自我复制，信号不衰减；5)可携带复杂调控元件和多样标示物等。

目前常用的嗜神经病毒主要有来源于α疱疹病毒科的伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)和单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)以及棒状病毒科的狂犬病毒(Rabies virus,RV)，其它还有水泡性口炎病毒(vesicμLar stomatitis virus,VSV)等，其中PRV Bartha株和RV是逆向跨突触感染，VSV两个方向都可以传播，相对能特异顺行跨突触传播的是HSV-1H129株，和神经冲动传递的方向一致，非常适于标记输出神经网络。

单纯疱疹病毒1型(HSV 1)是一种普遍分布、条件致病的病原体，是大的具囊膜的病毒，直径约200nm，核心为双链DNA基因组，约153kb，由共价连接的长片段(UL)和短片段(US)组成，每一片段末端均含反转重复序列，因此可以形成4种同分异构体。

HSV野生型病毒毒性较大，中枢感染小鼠一般1周内会全部死亡。HSV最主要的神经毒力因子基因已被鉴定为γ34.5基因，编码参与病毒复制调控、组装、细胞自噬等重要过程的多功能ICP34.5蛋白。γ34.5基因在HSV基因组中有两个拷贝，分别位于UL长片段的末端重复序列TRL和IRL中，基因全长1007bp，编码具有多功能的ICP34.5蛋白(编码框如SEQ IDNO.1所示)：机体细胞被病原体或病毒感染后很快会激活固有免疫应答，包括诱导干扰素及其它重要抗病毒蛋白的产生。病毒感染使真核细胞翻译起始因子eIF2α磷酸化，会导致细胞蛋白合成终止，从而起到阻抑病毒复制的效果。而HSV为复制自身进化出多样策略逃避宿主防御机制，ICP34.5通过与宿主蛋白磷酸酶1(PP1)结合形成复合物，调控介导eIF2α的去磷酸化，从而保持宿主细胞蛋白的合成代谢，服务于病毒复制过程。ICP34.5另外还具有拮抗干扰素诱导产生抗病毒蛋白、拮抗宿主细胞自噬清除病毒等功能。

如上所述，HSV病毒自身性质，目前HSV工具病毒普遍存在毒性大、携带外源基因表达丰度低的缺陷。脑图谱绘制技术中顺行跨突触示踪研究应用最多的是HSV-1H129株，不过目前HSV工具病毒普遍存在毒性大、灵敏度低的缺陷，H129是从一个脑炎死亡患者脑部分离的毒株，野生株具有很大的毒性，感染的细胞一般两天内很快凋亡；小鼠经脑感染H129后一般只能存活3-5天，无法开展长时程神经环路结构示踪，更谈不上用于功能环路解析。因此，HSV H129病毒的自身毒性是目前其作为神经系统示踪工具面临的最大问题之一。