[发明专利]一种减毒、复制可控的顺向HSV示踪系统及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种跨突触的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组1型单纯疱疹病毒通过H129株基因组中神经毒力因子编码基因γ34.5两个拷贝基因被完全敲除；然后将表达可控的γ34.5自降解重组基因回补进γ34.5原来基因位点得到；

所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中包含敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST；

优选地，敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，降解序列PEST的序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST之间以柔性链连接，优选地，柔性链选自如SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，在柔性链和降解序列PEST之间还包括TEVsite；TEVsite来源于烟草花叶病毒的7氨基酸剪切序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly，可特异的被TEV蛋白酶识别并切割融合蛋白(Gln-Gly间为切割位点)，TEVsite序列如SEQ ID NO.5所示。

4.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，表达可控的γ34.5自降解重组基因编码框的3’端还有γ34.5基因3’端非编码序列，其序列如SEQ ID NO.6所示。

5.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因的序列如SEQ ID NO.7所示。

6.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还包含编码报告蛋白的基因；

优选地，所述报告蛋白选自荧光蛋白、发光蛋白等。

更优选地，所述荧光蛋白选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP；发光蛋白选自荧光素酶等。

7.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还进一步包含内部核糖体进入位点；

优选地，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因串联荧光蛋白报告基因的完整序列如SEQ ID NO.8所示。

8.权利要求1-7任一项所述的重组1型单纯疱疹病毒在制备神经环路顺行跨多级突触示踪剂、制备大容量基因转导载体、制备神经系统靶向基因治疗的药物载体、制备病毒复制与致病机理分析的试剂、制备动物感染模型建立的试剂、制备抗病毒药物筛选的试剂、制备作为溶瘤治疗的溶瘤病毒药物中的用途。

9.一种神经环路顺行跨多级突触标记示踪的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-7任一项所述的重组1型单纯疱疹病毒注射到目标区域；

优选地，所述目标区域选自受试者脑区或其他目标组织或器官；

更优选地，所述受试者选自各种实验动物。

10.权利要求1-7任一项所述的跨突触的重组1型单纯疱疹病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1)制备敲除神经毒力因子编码基因γ34.5的两个拷贝基因的1型单纯疱疹病毒；

S2)制备用于重组γ34.5基因回补HSV基因的外源基因表达盒的靶向载体；

S3)步骤S2)获得的靶向载体以及步骤S1)制备获得的敲除神经毒力因子编码基因γ34.5的两个拷贝基因的1型单纯疱疹病毒同转染细胞后进行重组，通过挑斑纯化后获得上述跨突触的重组1型单纯疱疹病毒；

其中，步骤S2)中，靶向载体中外源基因表达盒中包含表达可控的γ34.5自降解重组基因，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中包含敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST；

优选地，敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，降解序列PEST的序列如SEQ ID NO.4所示；

优选地，参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST之间以柔性链连接，优选地，柔性链选自如SEQ ID NO.3所示；

优选地，在柔性链和降解序列PEST之间还包括烟草花叶病毒特异的剪切位点TEVsite，其序列如SEQ ID NO.5所示；

优选地，表达可控的γ34.5基因的3’端还有γ34.5基因3’端非编码序列，其序列如SEQID NO.6所示；

优选地，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因的序列如SEQ ID NO.7所示；

优选地，为了便于重组时的筛选，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还包含编码报告蛋白的基因；

优选地，所述报告蛋白选自荧光蛋白、发光蛋白；更优选地，所述荧光蛋白选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP；发光蛋白如荧光素酶等；

优选地，所述靶向载体中外源基因表达盒中还包含内部核糖体进入位点；

优选地，所述完整的含回补γ34.5自降解嵌合基因在内的外源基因表达盒序列如SEQID NO.8所示。