[发明专利]一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，属于分析检测领域。该方法是以硫酸软骨素C为标准样品，将酶解法与蒽酮‑硫酸法相结合，酶解前通过超滤去除发酵液中小分子杂质，再用硫酸软骨素裂解酶将硫酸软骨素类多糖酶解为寡糖，再通过超滤去除大分子杂质，得到的过滤液使用蒽酮‑硫酸法测定糖含量。该方法偶联了酶专一性分解硫酸软骨素类多糖的化学分析方法，只需通过两个步骤，即可将复杂成份中造成定量干扰的小分子、大分子杂质去除，结合蒽酮‑硫酸法可以简便、准确的测定复杂培养液中的硫酸软骨素类多糖含量。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)，是一类广泛存在于动物结缔组织中的酸性糖胺聚糖类大分子多糖，在生物体内多以蛋白聚糖侧链形式存在，其碳链骨架由葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1,3和β-1,4糖苷键(4-GlcA-β-1,3-GalNAc-β-1)交替连接而成的重复二糖单元组成。根据其硫酸化位点的不同，可以将硫酸软骨素类多糖分为无硫酸化的软骨素(CS-O)、硫酸软骨素A(CS-A)、硫酸软骨素B(CS-B)、硫酸软骨素C(CS-C)和硫酸软骨素E(CS-E)等类型，其中，动物来源的硫酸软骨素多为CS-A和CS-C。硫酸软骨素被称为“人体黄金”，在治疗风湿病、骨质疏松症、关节炎、腰间盘突出、抗肿瘤、抗补体药物、抗凝血等方面具有重要作用。近年来，硫酸软骨素作为一种新型药用活性成分，在医药制剂、医学材料、日化产品、化妆品、生发剂、保健品等领域应用广泛，越来越受到人们的重视。

鉴于此，硫酸软骨素的新型制备方法成为了研究热点。硫酸软骨素的传统制备方法以动物软骨组织为原料，采用酶法、碱法等提取，这些方法包含了繁复冗长的提取、纯化过程。而且动物来源的硫酸软骨素面临结构不均匀、原材料不稳定、容易受到动物源致病微生物及硫酸角质素(KS)污染等问题，已经难以满足现代规模化高质量生产硫酸软骨素的需求。通过培养微生物细胞而获得大量的软骨素，然后经过硫酸化修饰，制备硫酸软骨素是具有巨大经济效益和开发潜力的生产工艺。公布号为CN103228781A的中国发明专利公开了一种软骨素的生物技术制备，该专利构建了大肠杆菌kfoE基因敲除菌株，使得将果糖残基加至软骨素主链的酶基因失活，从而制备软骨素，为进一步硫酸化制备硫酸软骨素创造了条件。

然而，为了通过发酵法生产硫酸软骨素，还需构建新的高产菌株以及优化发酵工艺，比如碳源、氧气、发酵工艺，在此优化过程中需要对软骨素含量进行及时检测。由于缺少软骨素的标准样品等原因，目前尚没有针对软骨素的统一检测方法。软骨素存在于微生物的发酵液中，微生物培养液中的复杂成分如培养基成分、细胞碎片、蛋白质、代谢产物等，会严重干扰软骨素的定量检测。如果参照硫酸软骨素的传统测定方法，直接对发酵液中的软骨素进行比色法测定，会因培养基中含有的单糖等低分子化合物，以及蛋白质与微生物代谢产生的肽聚糖等高分子化合物而对实验结果造成极大干扰。色谱法和核磁共振法检测，也需要经过复杂耗时的纯化过程，获得单一的可用于定量的峰，但多次纯化会造成软骨素的损失；复杂的来源于培养基或细胞代谢的高分子成分在纯化过程中，难以有效去除，会干扰分析结果；核磁共振、色谱法使用的实验仪器，需预约或使用时间长，通常延误大量时间。

因此，需要开发一种新的快速定量检测发酵液中硫酸软骨素类多糖，尤其是软骨素的方法。

发明内容

1.要解决的问题

本发明针对目前缺少软骨素标准样品，以及培养基成分干扰而无法定量检测发酵液中软骨素的含量的问题，提供了一种发酵液中软骨素含量的定量检测方法。该方法是以硫酸软骨素C为标准样品，将酶解法与蒽酮-硫酸法相结合，酶解前通过超滤去除发酵液中小分子杂质，再用硫酸软骨素裂解酶将软骨素酶解为寡糖，再通过超滤去除大分子杂质，得到的寡糖过滤液使用蒽酮-硫酸法测定糖含量。该方法创造性地偶联了酶专一性分解软骨素与化学分析方法，只需通过两个步骤，即可将复杂成份中造成定量干扰的小分子、大分子杂质去除，可以简便、准确的测定复杂培养液中的软骨素含量。