[发明专利]一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法

权利要求书

1.一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：绘制标准曲线：使用标准品绘制标准曲线；

S2：样品中硫酸软骨素类多糖含量测定：

S21：超滤去除样品中小分子杂质；

S22：使用硫酸软骨素裂解酶将硫酸软骨素类多糖酶解为寡糖；

S23：超滤去除大分子杂质；

S24：使用蒽酮-硫酸法测定糖含量，即超滤去除大分子后与蒽酮反应试剂反应，测定OD620，根据S1中的标准曲线计算硫酸软骨素类多糖的含量。

2.根据权利要求1所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，还包括步骤S3损失校正：

S31：损失率计算，配制标准品溶液，与样品同等条件下处理，损失率＝(理论的标准品含量-测定的标准品含量)/理论的标准品含量；

S32：损失校正，样品中硫酸软骨素类多糖含量＝S24中计算的硫酸软骨素类多糖含量/(1-损失率)。

3.根据权利要求1或2所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，所述标准品为硫酸软骨素C；所述硫酸软骨素类多糖包括软骨素、硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C或硫酸软骨素E。

4.根据权利要求3所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，所述硫酸软骨素裂解酶为硫酸软骨素裂解酶AC。

5.根据权利要求4所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，所述硫酸软骨素裂解酶AC为硫酸软骨素裂解酶AsChnAC。

6.根据权利要求4或5所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，

所述S21中超滤去除样品中小分子杂质包括：取样品加入10-30KDa超滤管，12000-14000g离心30-60min，去除发酵液中小分子杂质；

和/或所述S22中硫酸软骨素类多糖酶解包括：向超滤管加pH7Tris-HCl，倒置超滤管，1000g离心，加pH7Tris-HCl定容至一定体积；加同等体积的AsChnAC于定容后的溶液中，恒温水浴反应至酶解完全，煮沸，冷却后12000-14000g离心，收集上清；

和/或所述S23中超滤去除大分子杂质包括：将S22中收集上清加入10KDa超滤管，12000-14000g离心30-60min，得到过滤液。

7.根据权利要求6所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，所述S21中样品超滤前用0.22-0.45μm滤器过滤。

8.根据权利要求7所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，所述样品过滤前与pH7Tris-HCl缓冲溶液混匀，混匀比例为1:1。

9.据权利要求8所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，所述S24中超滤去除大分子后与蒽酮反应试剂反应包括：将样品与蒽酮反应试剂按照体积比1:3混匀，将混合液于100℃水浴，再冰浴，测定OD620。

10.据权利要求9所述的一种发酵液中硫酸软骨素类多糖含量的定量检测方法，其特征在于，所述S1中绘制标准曲线包括：准确称取标准品溶于ddH₂O，配制成不同浓度梯度，分别与蒽酮反应试剂按照体积比1:3混匀，100℃水浴，再冰浴，测定OD620，以标准品含量为横坐标，吸光值为纵坐标，线性回归绘制标准曲线。