[发明专利]ASCT元件驱动运行非常规TCA循环底盘菌株的构建方法

说明书

ASCT元件驱动运行非常规TCA循环底盘菌株的构建方法，包括：从P.denitrificans菌株Pd1出发，阻断常规乙酸活化模块和激活乙酸驱动的非常规TCA循环模块。通过阻断乙酸活化模块和激活TCA模块中的ASCT功能元件改造底盘细胞中心代谢网络，构建具有乙酸驱动葡萄糖代谢能力的底盘细胞。本发明有助于为实施以乙酰辅酶A为前体的其他底盘细胞及工程菌的改造与适配性研究提供理论指导和借鉴，也为开发乙酸利用提供一条全新的技术路线。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种ASCT元件驱动运行非常规TCA循环底盘菌株的构建方法。

背景技术

目前具有较高前景的生物合成3-HP的主要路线是以葡萄糖为底物的丙二酰辅酶A途径。该路线以常见的中间产物乙酰辅酶A为前体来合成3-HP，但是目前该路线合成3-HP的TYR(产物浓度、收率和生产率)技术指标较低，3-HP最高浓度为40.6g/L、收率为0.19g/g和生产率为0.56g/L/h。在葡萄糖合成3-HP系统中，异源过表达3-HP合成模块与宿主内源模块“适配性差”、配比不均衡，导致3-HP合成模块在底盘细胞中的前体乙酰辅酶A供给不足，造成3-HP的产量和产率低下。因此，改造底盘细胞内源全局代谢网络、提高前体乙酰辅酶A的供应，是构建葡萄糖高效合成3-HP底盘细胞及底盘细胞适配性的核心问题。

脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans，P.denitrificans)中存在一条非常规的乙酸:琥珀酸辅酶A-转移酶(ASCT)催化的乙酸活化路径，该路径与中心代谢TCA循环正交再生乙酰辅酶A(图1)。ASCT元件代偿琥珀酰辅酶A合成酶(SCS)构建非常规TCA循环模块有望改变宿主内源全局代谢网络，提升胞内乙酰辅酶A的供应。从化学计量平衡来看，1mol葡萄糖经过糖酵解途径理论上可以生成2mol乙酰辅酶A，乙酰辅酶A大部分进入常规TCA循环来维持细胞生长；而非常规TCA循环利用经济型非粮基底物乙酸(ASCT元件)驱动1mol葡萄糖代谢，在维持细胞生长能量和物质的同时，胞内还可积累高达2mol的乙酰辅酶A。由此可见，激活ASCT元件改造底盘细胞内源全局代谢网络增加前体乙酰辅酶A供应，可以为3-HP和其它不同乙酰辅酶A衍生产品高效底盘细胞的开发提供一种新的思路和借鉴。乙酸(ASCT元件)驱动的非常规TCA循环已经在多种细菌中发现[12]，但是通过ASCT元件改造和构建底盘细胞、封存葡萄糖中的乙酰辅酶A，提高乙酰辅酶A衍生产品生物合成的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于一株ASCT元件驱动运行非常规TCA循环底盘菌株的构建方法，从P.denitrificans菌株Pd1出发，阻断常规乙酸活化模块(敲除pta-ackA和acs基因)和激活乙酸(ASCT元件)驱动的非常规TCA循环模块(敲除sucCD基因)。通过阻断乙酸活化模块和激活TCA模块中的ASCT功能元件改造底盘细胞中心代谢网络，构建具有乙酸驱动葡萄糖代谢能力的底盘细胞。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

一株ASCT元件驱动运行非常规TCA循环底盘菌株的构建方法，包括：

从脱氮假单胞菌株出发，通过阻断乙酸活化模块和激活TCA模块中的ASCT功能元件改造底盘细胞中心代谢网络，构建具有乙酸驱动葡萄糖代谢能力的底盘细胞。

进一步的，所述方法包括：

S1：从脱氮假单胞菌株出发，依次从基因组中敲除pta-ackA、acsI，acsII，acsIII和sucCD基因，分别得到缺失AckA-Pta途径的突变体菌株，同时缺失AckA-Pta途径和ACS途径的突变体菌株，以及内源ASCT元件代偿SCS元件功能的突变体菌株；

S2：在S1获得的突变体菌株中敲除sucCD基因，以激活ASCT元件，代偿SucCD功能，构建一株运行非常规TCA循环的菌株；

S3：在S2获得的菌株中敲除编码ASCT的基因aarC，获得突变体；