[发明专利]ASCT元件驱动运行非常规TCA循环底盘菌株的构建方法

权利要求书

1.ASCT元件驱动运行非常规TCA循环底盘菌株的构建方法，其特征在于，包括：

从脱氮假单胞菌株出发，通过阻断乙酸活化模块和激活TCA模块中的ASCT功能元件改造底盘细胞中心代谢网络，构建具有乙酸驱动葡萄糖代谢能力的底盘细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

S1：从脱氮假单胞菌株出发，依次从基因组中敲除pta-ackA、acsI，acsII，acsIII和sucCD基因，分别得到缺失AckA-Pta途径的突变体菌株，同时缺失AckA-Pta途径和ACS途径的突变体菌株，以及内源ASCT元件代偿SCS元件功能的突变体菌株；

S2：在S1获得的突变体菌株中敲除sucCD基因，以激活ASCT元件，代偿SucCD功能，构建一株运行非常规TCA循环的菌株；

S3：在S2获得的菌株中敲除编码ASCT的基因aarC，获得突变体；

S4：获取不同来源的编码ASCT蛋白的aarC基因，经过密码子优化后合成不同来源的aarC，在大肠杆菌-脱氮假单胞菌穿梭质粒pUCPK中构建含有这些不同来源ASCT基因表达的质粒，并经电转化导入步骤S3制备的突变体中；在以乙酸为唯一碳源和能源的无机盐培养基中分别考察不同来源的ASCT的活性，确定最高活性的ASCT，对其进行定向进化，获得高效乙酸驱动代谢葡萄糖的底盘细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱氮假单胞菌株是P.denitrificans菌株Pd1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：

从脱氮假单胞菌株出发，依次从基因组中敲除pta-ackA、acsI，acsII，acsIII和sucCD基因，分别得到缺失AckA-Pta途径的突变体菌株，同时缺失AckA-Pta途径和ACS途径的突变体菌株，以及内源ASCT元件代偿SCS元件功能的突变体菌株：ZAP(Pd1Δpta-ackA)、ZAPΔacs和ZAPΔacsΔsucCD。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定向进化的方法包括：

利用Error-prone PCR技术对确定的ASCT进行定向进化，建立ASCT突变体文库；通过在平板上建立突变体文库，并根据平板上菌落的生长快慢对突变体文库进行筛选，得到ASCT阳性突变体，进而获得显著增强限速酶ASCT的活性。