[发明专利]一种样本杂交前预处理试剂及其使用方法

权利要求书

1.一种样本杂交前预处理试剂，其特征在于：所述预处理试剂由预处理液、酶缓冲液、胃蛋白酶以及洗脱液组成：(1)预处理液:称取81.07-81.1g硫酸氰钠于玻璃瓶内加纯化水定容至1L，搅拌至完全溶解，即得预处理液；

(2)酶缓冲液：称取5.5-5.6ml的浓盐酸于玻璃瓶内，加纯化水稀释至1000ml，混合均匀，即得酶缓冲液；

(3)胃蛋白酶：称取140-141mg胃蛋白粉倒入冻存管中，盖紧盖子，即得胃蛋白酶；

(4)洗脱液：称取175-175.3g氯化钠和88-88.2g柠檬酸三钠，加入合适的容器中，加纯化水定容至1L，搅拌至完全溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调PH值至5.3±0.1，即得20×SSC溶液；

将得到的20×SSC溶液量取100ml和3ml的NP-40，加入合适的容器中，加纯化水定容至1L，搅拌均匀后，用11mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调PH值至7.0-7.5，即得洗脱液。

2.一种如权利要求1所述的样本杂交前预处理试剂使用方法，其特征在于：包括试剂准备、样本处理以及杂交后洗脱的工序。

3.根据权利要求2所述的样本杂交前预处理试剂使用方法，其特征在于：所述试剂准备包括下述步骤：

S1：将50mL预处理液倒入染缸中，将染缸置于80±1℃水浴锅中，保持染缸内溶液温度为80±1℃备用；

S2：将50mL酶缓冲液倒入染缸并置于37±1℃水浴锅中，保持确保染缸内溶液温度为37±1℃备用，待需要时添加140mg的胃蛋白酶进入酶缓冲液中，充分溶解后得到胃蛋白酶工作液；

S3：准备2个染缸各加入50mL的洗脱液，分别置于常温和73±1℃水浴锅中备用；

S4：分别量取700mL以及850mL的无水乙醇，使用纯化水分别稀释至1000mL，室温密封保存备用。

4.根据权利要求2所述的样本杂交前预处理试剂使用方法，其特征在于：所述样本处理包括下述步骤：

S1烤片：将切片在空气中略微干燥后，放在65℃-70烤片机上烤片3.8-4h，备用；

S2脱蜡：在室温下，将玻片浸入二甲苯脱蜡两次，各10～15分钟；

S3脱水:脱蜡完成后，在室温下，将玻片浸入无水乙醇中脱水两次，各5分钟；取出玻片，去除玻片上的残余溶液；

S4预处理：将玻片浸入步骤一中准备的80±1℃预处理液中处理10分钟；

S5去除溶液：取出玻片，将其浸入纯化水中处理1分钟，取出后去除玻片上的残余溶液；

S6消化：将玻片置于胃蛋白酶工作液中37℃消化10～60分钟；

S7浸泡：消化后，将玻片在纯化水浸泡1分钟；

S8脱水：浸泡后将玻片分别浸入步骤一中的到的70％和85％的乙醇溶液，以及100％乙醇中进行梯度脱水各1分钟；

S9干燥：脱水后取出玻片，室温干燥，备用，即可进行杂交。

5.根据权利要求2所述的样本杂交前预处理试剂使用方法，其特征在于：所述杂交后洗脱包括下述步骤：

S1：结束后，从杂交仪中取出玻片，用镊子去掉封片胶；

S2：在室温下，将玻片浸入步骤一中置于常温状态下备用的洗脱液中浸泡5分钟，除去盖玻片；

S3：取出玻片，将其放入步骤一中置于水浴锅中备用的已经预热至73±1℃的另一洗脱液中，漂洗2分钟；

S4：取出玻片，去除残留液体后，暗处晾干备用。

6.根据权利要求3所述的一种样本杂交前预处理试剂使用方法，其特征在于：所述染缸采用考普林染缸。

7.根据权利要求3所述的一种样本杂交前预处理试剂使用方法，其特征在于：S2中添加140mg的胃蛋白酶进入酶缓冲液的时间在样本脱蜡之前。