[发明专利]一种同步测定细菌多糖中多糖和磷含量的定量核磁方法

说明书

本发明公开了一种同步测定细菌多糖中多糖和磷含量的定量核磁方法，属于医药工程领域。本发明以六甲基磷酰三胺作为定量¹H‑和³¹P‑NMR法的内标物，定量¹H‑NMR法中的定量峰为六甲基磷酰三胺中六个甲基信号(化学位移为2.58和2.60ppm)；定量³¹P‑NMR法的定量特征峰为六甲基磷酰三胺中磷信号(化学位移为29.93ppm)。本发明可用于b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌荚膜多糖中多糖和磷含量的同步检测。本发明中检测液多糖浓度为5‑40mg/mL，依据定量峰积分值计算多糖和磷含量。本发明“一内标双定量”NMR法在检测含量的同时可鉴定多糖结构，操作简单，成本低，测试准确，无需对比品，测试时间短，样品可完整回收。

技术领域

本发明涉及一种同步测定细菌多糖中多糖和磷含量的定量核磁方法，属于医药工程技术领域。

背景技术

细菌性感染引起的肺炎和脑膜炎是威胁婴幼儿生命健康的严重疾病，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是引起相关疾病的主要致病菌。根据产生荚膜的情况，流感嗜血杆菌可分为产荚膜的6种血清型(a-f型)菌株和不产荚膜的不可分型菌株，而侵袭性感染主要由产荚膜的菌株引起。b型流感嗜血杆菌(Hib)是最主要的致病亚型，其引起的脑膜炎致死率高达5-10％，且约30％治愈者存在中枢神经系统缺陷。根据产生荚膜的情况，肺炎链球菌可分为97种血清型菌株，其中1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F这24种血清型涵盖引起婴幼儿重症肺炎的90％以上临床病例。

Hib和肺炎链球菌的耐药性不断提高，使其成为重要的公共卫生问题，促使了疫苗的开发和应用。荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)作为细胞表面的主要组分，具有高度的结构特异性和免疫原性，广泛应用于疫苗开发。全球已上市的Hib疫苗包括各种单联疫苗和多联疫苗，均采用该荚膜多糖作为半抗原，与载体蛋白结合制备Hib多糖结合疫苗。目前，我国上市的Hib疫苗包括单联疫苗和多联疫苗，其中单联疫苗主要由北京民海生物、沃森生物、赛诺菲、兰州所、智飞生物和成都欧林等生产，而多联疫苗分为赛诺菲的百白破脊灰-Hib五联疫苗、北京民海生物的百白破-Hib四联疫苗。值得注意的是，自上世纪90年代Hib多糖结合疫苗上市，Hib引起的侵袭性感染疾病得到了有效的控制。目前，我国上市的肺炎链球菌多糖疫苗包括美国辉瑞13价肺炎链球菌多糖结合疫苗(沛儿13)，云南沃森和北京民海生物的23价肺炎链球菌多糖疫苗和13价肺炎链球菌多糖结合疫苗。2020年，美国辉瑞肺炎疫苗沛儿13的销售额为58.3亿美元，是全球最畅销的疫苗品种，被称为“疫苗之王”。