[发明专利]一种合成香兰素的基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种合成香兰素的基因工程菌，其包括由香草酸合成天然香兰素的途径：香草酸在羧酸还原酶Car和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp的催化作用下生成天然香兰素。本发明通过将羧酸还原酶(Car)基因和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Sfp)基因导入宿主菌中，成功构建了能够高效催化香草酸还原生成香兰素的基因工程菌；同时，本发明还通过底物/产物耐受性驯化和全细胞催化过程优化调控相结合的方式来进一步提高天然香兰素的产量。多次重复实验表明，采用本发明的基因工程菌香兰素的最高产量能够达到4.05g/L，是目前已报道的相关研究中生物法催化香草酸生成香兰素的最高产量，这对生物法高效生产香兰素具有很大的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于基因重组和全细胞催化技术领域，涉及一种合成香兰素的基因工程菌及其应用，具体涉及高效转化香草酸生产天然香兰素的基因工程菌的构建及其应用。

背景技术

香兰素(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)是全世界使用非常广泛的一种食品调味剂，常用于食品、饮料、香水以及药品当中，天然香兰素是从兰科植物的种子荚中提取出来的一种植物次生代谢产物。全世界香兰素的年消费量超过16000吨，但由于兰科植物生长缓慢且植物中香兰素含量仅为香草豆荚干重的2％，食用香兰素中只有约0.25％来自天然香草豆荚。全球大部分香兰素的市场需求是通过化学法(主要有愈创木酚法和邻苯二酚法)合成香兰素来满足的，但此方法缺乏底物选择性并且污染环境。化学合成法的第二个缺点是化学合成的香兰素属于“非天然”香兰素，其生物相容性差，且附加值较低。

基于上述情况，我们决定通过使用天然底物结合生物工程技术生产天然香兰素，其产品被欧盟和美国的食品法规归类为天然香兰素。在各种天然底物中，以阿魏酸作为前体生物法合成香兰素的研究较早，但是香草酸作为另一种生物法合成香兰素的常用前体，其理化性质与阿魏酸相比有更多优势，具有化学性质稳定、水溶性良好、见光不易分解等优点。目前随着研究的不断深入，以香草酸作为底物生物法合成香兰素的产量与转化率已经有了显著提升，在2000年Stentelaire等进行了利用P.cinnabarinus MUCL39533转化香草酸生产香兰素，产量能够达到1.58g/L，摩尔转化率为82.1％，但是生物法转化香草酸生产香兰素的产量和转化率仍旧有很大的提升空间。

因此，目前存在的问题是构建更加高效转化香草酸生产天然香兰素的基因工程菌并对全细胞催化过程进行优化调控。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种合成香兰素的基因工程菌。该基因工程菌能够高效地催化香草酸生产天然香兰素；同时，本发明还通过底物/产物耐受性驯化和全细胞催化过程优化调控相结合的方式来进一步提高天然香兰素的产量；本发明所构建的工程菌能够非常高效地催化香草酸生产天然香兰素。

为此，本发明第一方面提供了一种合成香兰素的基因工程菌，其包括由香草酸合成天然香兰素的途径：香草酸在羧酸还原酶Car和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp的催化作用下生成天然香兰素。

根据本发明，所述基因工程菌为含有编码羧酸还原酶的基因Car和编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的基因Sfp的合适宿主生物体。

在本发明的一些实施例中，所述编码羧酸还原酶的基因Car包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Car、来源于海分枝杆菌的基因Car以及基于上述基因的序列的不引起所述羧酸还原酶功能改变的基因取代、缺失、加入或密码子优化。

优选地，所述编码羧酸还原酶的基因Car包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Car或来源于艾阿华诺卡氏菌且经过密码子优化的基因Car、来源于海分枝杆菌的基因Car或来源于海分枝杆菌且经过密码子优化的基因Car。

在本发明的另一些实施例中，所述编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Sfp、来源于海分枝杆菌的基因Sfp、来源于枯草芽孢杆菌的基因Sfp以及基于上述基因的序列的不引起所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶功能改变的基因取代、缺失、加入或密码子优化。