[发明专利]一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明针对组学鉴定的批量miRNA‑靶基因对，先后运用双荧光素酶报告检测技术和荧光原位杂交技术验证候选miRNA及其靶基因的互作关系并定位其在组织和细胞中的位置，精确地实现了节点基因和关键开关miRNA在发育组织中的定位，能够精确地、具有时空特异性地反映植物组织发育过程分子调控的特点，对分子设计育种具有很高的指导意义和应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用。

背景技术

miRNA是一类长度约为21nt的非编码小分子RNA，是真核生物中几乎所有生物过程的关键调控因子。在植物体内，miRNA能够通过与靶mRNA分子的互补序列结合，使其降解或抑制其翻译，在转录后水平调控靶基因的表达，一直是遗传、发育、干细胞等多个研究领域中的研究热点。例如，miR165/miR166通过影响HD-ZIP III转录因子基因的表达，调控SAM终止、器官极性改变和维管组织和束间纤维发育缺陷等。同时Argonautes(AGOs)通过竞争性结合miRNA165/166调控拟南芥茎端分生组织发育和叶片极性形成。这些结果均表明miRNA能够联合上游调控基因和下游靶基因，在植物的胚胎发育、分生组织和器官发生等关键发育过程中发挥重要作用。

此外，miRNAs通过参与调控植物物质和能量代谢、植物激素信号传导以及逆境响应相关生物学途径，影响植物的发育与形态建成。如microRNA165/166能够联合植物激素信号传导途径共同维持拟南芥根部维管束构型的稳定(Muraro et al.,2014)。以往研究成果显示几乎所有miRNAs均受到多个转录因子的调控，同时miRNAs也作用于包括转录因子基因的众多靶基因。不仅如此，转录因子通过特异结合下游基因启动子区的DNA顺式作用元件，对基因(包括miRNA)的转录起到激活或者抑制等作用，形成“miRNA-转录因子-靶基因(miRNA)”组成的较为复杂的转录调控网络，参与包括植物生长和发育的多个生物通路。即miRNA通过与上游调控基因和下游靶基因构成复杂调控网络，参与植物的物质和能量代谢、激素信号转导和逆境胁迫响应等多生物过程，在转录水平调控植物的生长发育。

目前也有利用miRNA研究植物生长发育的相关记载，比如，研究报道“IntegratedAnalysis of Small RNA,Transcriptome and Degradome Sequencing Provides NewInsights into Floral Development and Abscission in Yellow Lupine(Lupinusluteus L.)”和“Integrated transcriptome,small RNA and degradome sequencingapproaches provide insights into Ascochyta blight resistance in chickpea”中团队均发掘得到了候选的miRNA，检测到了差异表达的miRNA，虽然进行了降解组检测，找到了部分miRNA降解靶基因位点，但是混样后很难确定miRNA-靶基因对是否来自相同的生长发育时期，即只是在序列上存在互作关系，存在假阳性。虽然运用qRT-PCR检测到两者表达量存在负相关关系，但是没有对候选miRNA-靶基因对在细胞中是否能够互作进行验证，也没有对miRNA和靶基因在植物组织中的位置进行明确，存在很高的假阳性概率。利用找到的候选miRNA及其靶基因构建了调控网络，但由于关键节点miRNA及其靶基因存在很高的假阳性概率，也是不能真正反映植物发育过程，对指导育种的价值不大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用，能够精确地实现节点基因和miRNA在发育组织中的定位，从而精确地、具有时空特异性地反映植物组织发育过程分子调控的特点。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种构建植物发育分子调控网络的方法，所述方法包括以下步骤：