[发明专利]一种人工改造的β-半乳糖苷酶GaLT1及其在水解乳糖中的应用

说明书

本发明公开了一种人工改造的β‑半乳糖苷酶GaLT1及其在水解乳糖中的应用，所述β‑半乳糖苷酶GaLT1是在来源于T.scotoductus的野生型β‑半乳糖苷酶GaLT0的N端氨基酸序列连接了一个人工改造的双亲短肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明β‑半乳糖苷酶GaLT1相较于野生型的β‑半乳糖苷酶GaLT0的温度稳定性得到了显著改善，55℃的半衰期提高10倍；此外，β‑半乳糖苷酶GaLT1的牛奶乳糖降解率也明显提高，55℃、2h内能降解牛奶中95％的乳糖，达到无乳糖奶制品的国家标准。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人工改造的β-半乳糖苷酶GaLT1及其在水解乳糖中的应用。

背景技术

乳糖是一种二糖，由葡萄糖和半乳糖组成。牛奶中乳糖含量十分丰富。部分人群的小肠黏膜的乳糖酶分泌不足甚至不分泌，导致无法有效水解乳糖，该症状称为乳糖不耐症。目前市场上已出现针对该消费人群的无乳糖奶制品(乳糖含量0.5％，w/w，卫监督发[2007]300 号)。制备这些无乳糖奶制品的常见方法是利用乳糖酶(即β-半乳糖苷酶，β-gaLactosidase， EC:3.2.1.23)对牛奶中的乳糖进行降解。

β-半乳糖苷酶广泛分布在动物、植物和微生物中。目前，已有两款商品化的β-半乳糖苷酶，但是价格偏贵、水解时间偏长。例如商品化的黑曲霉来源的β-半乳糖苷酶在55℃实现牛奶中乳糖的彻底降解，需要水解12h(Rosolen et al 2015)；商品化的克鲁维酵母来源的β-半乳糖苷酶在2℃实现牛奶中乳糖的彻底降解需要24h(Horner et al 2011)。

β-半乳糖苷酶的牛奶乳糖水解分为三种策略。一是低温(10℃以下)长时间水解。往往是把酶作为食品添加剂添加到牛奶中，利用牛奶的储存期进行水解。这对酶的食品源来源有很苛刻的要求；二是中温(37℃左右)水解，该温度是很多微生物的最佳繁殖温度，因此酶解全程必须在严格的无菌条件下进行，成本和工艺要求高；三是高温(55℃以上)短时间水解。该技术可以把固定化酶水解乳糖和巴氏杀菌耦合，工艺二合一，效率也更高；而且酶往往制备为固定化酶，不向牛奶中引入外源蛋白，安全性高。因此，探索高温β-半乳糖苷酶一直是生产无乳糖奶制品研究的热点之一。

目前有不少高温β-半乳糖苷酶的报道，但一些高温的β-半乳糖苷酶的热稳定性并不高。例如，Sandra W等报道的β-半乳糖苷酶在最适温度50℃下的半衰期仅为10min；ArreoLa等报道的β-半乳糖苷酶在最适温度55℃下的半衰期仅为8min。一些热稳定性较好的高温β-半乳糖苷酶的水解活性却比较低。例如，中国发明专利201210127007.0中的β-半乳糖苷酶在 65-69℃时仅能水解牛奶中80％的乳糖；中国发明专利201510358266.8中的β-半乳糖苷酶在 60℃时仅能水解牛奶中约70％的乳糖。因此，挖掘同时满足热稳定性好和乳糖水解率高的高温β-半乳糖苷酶，对无乳糖奶制品行业的发展具有重要意义。

提高酶的热稳定性的方法很多，融合双亲短肽是一种比较好的方法，不容易引起酶催化活性的下降。目前双亲短肽的设计方案多种多样，有不少成功的报道，但是同时也有不少无效甚至更差的报道。例如，中国发明专利201810069643.X中尝试了7条不同的双亲短肽对一个葡萄糖氧化酶的温度稳定性的影响，发现有1条双亲短肽会使酶的稳定性变差，其余对酶的稳定性都有不同程度的提升，但是最高的在60℃仅仅孵育30min。中国发明专利2109776686A中报道了在一个脂肪酶的N端分别融合2个不同的双亲短肽，略微提高了酶的热稳定性。该脂肪酶本身的热稳定性比较差，半衰期仅25min，双亲肽融合后的酶的半衰期提高到35和45min。双亲短肽的氨基酸的种类和长度都会影响酶的性质，而且没有一个明显的规律。这就要求在试验中，设计多种双亲短肽，通过试验测试，找到具体某个酶的相对最佳匹配的双亲短肽。

发明内容