[发明专利]基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法

说明书

本发明涉及一条能有效将该打靶质粒编辑至ROSA26基因的gRNA，利用该gRNA采用CRISPR/Cas9系统通过显微注射到NOD/SCID小鼠的受精卵中，成功构建肝脏中限制表达uPA的小鼠模型，利用该限制表达uPA造成肝损伤的小鼠模式可进一步构建人源化肝脏小鼠模型，以及使用人源化肝脏小鼠模型为深入研究病毒性肝炎及嗜肝病毒感染的传染病发病机制及筛选抗病毒药物开发奠定基础。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法，还涉及构建人源化小鼠的CRISPR/Cas9系统。

背景技术

病毒性肝炎是危及全球公共卫生的主要问题之一，其传染性强、死亡率高。尤其以甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)五种嗜肝性病毒引起的病毒性肝炎的流行呈现局部突发性增加之势。目前尽管拥有预防甲型和乙型肝炎病毒的疫苗及治疗乙肝、丙型肝炎病毒的一些方法，但病毒感染尚未得到完全控制。这是由于这些病原体对属主的取向性，严重限制了对它们的研究。

虽然对黑猩猩的研究一直是破译病原体致病机制和验证疫苗效率以及抗病毒药物筛选方面唯一的手段；但很低的慢性感染率和缺乏肝纤维化，成本高、队列规模小等因素和出于道德考虑限制了它们的使用。廉价小动物模型如小鼠是最适合于这些研究的选项。小鼠体内的某些组成部分与人类不尽相同，特别是其免疫系统。携带人肝细胞合并功能良好的人免疫系统小鼠模型是肝炎病毒研究亟需的模型。这种双系统重建的人源化小鼠可通过向免疫缺陷小鼠体内共同注射人CD34+造血干细胞(HSC)和成人肝细胞来实现重建，同时还能提高肝脏嵌合程度。最新的研究表明：共同移植有利于嵌合肝中人免疫系统的重建，包括Kupffer细胞，DC细胞和NK细胞在内的人免疫细胞与人肝细胞紧密共定位；人肝细胞可产生IL-3，IL-15，GM-CSF，M-CSF，MCP-1，CXCL-1和CXCL-10，这些因子对于人免疫细胞的迁移、发育、分化非常重要，并且这些细胞与小鼠之间没有交叉反应。这种具有肝脏中重建的人免疫系统非常适合于病毒性肝炎发病机理的研究。

现在可供选择的人源化小鼠构建模式包括：尿纤溶酶原激活剂(uPA+/+)小鼠模式、富马酰乙酰乙酸水解酶(Fah-/-)小鼠模式、TK-NOG转基因小鼠模式和AFC 8模式。白蛋白-尿纤溶酶原激活物(Alb-uPA)转基因小鼠是最早被用于构建人源化小鼠模式，可用于肝炎病毒感染研究，uPA在肝细胞中的表达可引起肝细胞损伤，从而允许小鼠或人肝细胞在移植后选择性扩增实现生长优势，但由于其肝损伤不受控制，限制了它的广泛应用。AFC 8模式建立的双嵌合小鼠(AFC8-Hu HSC/Hep)，该支持HCV在肝脏中的感染，并产生人T细胞对HCV的应答；HCV感染引发肝脏炎症，转化成慢性炎症后，星状细胞的活化诱发人成纤维基因的表达、肝脏纤维化。但该模型操作极为复杂，小鼠死亡率很高，也未见进一步的报道。

课题组前期首次成功构建具有生物学功能的慢病毒质粒；实现了在细胞水平上对Alb-uPA基因表达的有效控制。虽然取得了上述这些研究成果，但其实验数据主要来自于体外细胞培养模型，是否能用于动物模型尚待进一步的验证。我们曾尝试随机地用原核注射的方式将目的基因质粒注入小鼠受精卵中；也通过重新优化慢病毒质粒中目的基因与调控基因的排列顺序，再通过原核注射的方式注入到小鼠受精卵中。小鼠要么不表达，要么随机表达不受控制、更无法传代，都没有取得良好的效果。

本发明在继续深入研究创建一种全新的极大的实现人肝替代和无小鼠免疫成分的嵌合小鼠模型，以期为深入研究病毒性肝炎及嗜肝病毒感染的传染病发病机制及抗病毒药物开发奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9构建人源化小鼠的gRNA，还提供一种构建人源化小鼠的CRISPR/Cas9系统。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：