[发明专利]基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9构建人源化小鼠的gRNA，其特征在于，所述gRNA由5’-3’的序列如SEQ ID No.7所示。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9构建人源化小鼠的gRNA，其特征在于，用于制备gRNA的引物对序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。

3.一种构建人源化小鼠的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，该系统由cas9 mRNA、gRNA和donor DNA重组质粒组成，所述gRNA由5’-3’的序列如SEQ ID No.7所示，所述donor DNA重组质粒为R26-e(CN362)-1，该重组质粒包含Rosa26位点5’同源臂、PTight启动子、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因、第一ployA、白蛋白启动子Alb promoter、四环素反式作用因子、第二ployA和Rosa26位点3’同源臂，具体结构见说明书附图的图5所示。

4.基于权利要求3所述CRISPR/Cas9系统构建pTight-uPA-Alb-rtTA转基因小鼠的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

a.分别在体外合成cas9 mRNA、gRNA和donor DNA重组质粒；

b.再将cas9 mRNA、gRNA和donor DNA重组质粒共同显微注射到NOD/SCID小鼠受精卵中，得到F0代小鼠；

c.将步骤b得到的F0代小鼠与NOD/SCID小鼠交配获得F1代小鼠即可。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，b步骤还包括将得到F0代小鼠用PCR和测序的方法进行基因型鉴定。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，PCR反应体系50μl：ddH₂O 31μl，PrimeStar GXL PCR Buffer 10μl，2.5mM dNTP 4μl，Forward Primer 1μl，ReversePrimer 1μl，PrimeStar GXL DNA Polymerase 2μl，genomic DNA 1μl。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，5’同源臂扩增用Forward Primer如SEQ ID No.10所示，Reverse Primer如SEQ ID No.11所示；3’同源臂扩增用ForwardPrimer如SEQ ID No.12所示，Reverse Primer如SEQ ID No.13所示。

8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，显微注射时按cas9 mRNA5ng/μl、gRNA 2ng/μl和donor DNA重组质粒20ng/μl注射。

9.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法得到的小鼠模型。

10.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法得到的小鼠模型在筛选肝损伤药物中的应用。