[发明专利]一种HA标签融合表达载体的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种HA标签融合表达载体的制备方法，该方法为：用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物，以pRGEB32Bar‑Cas9质粒为模板，得到2×35S启动子PCR回收产物，连接反应得到中间载体pGL‑35S，双酶切后连接MCS退火引物，得到中间载体pGL‑35S‑MCS，双酶切后连接NosTer序列，得到中间载体pGL‑35S‑MCS‑Nos，双酶切后连接变性退火的连接肽Linker引物，得到中间载体pGL‑35S‑MCS‑Linker‑Nos，双酶切后连接HA标签退火引物，得到HA标签融合表达载体。本发明制备的HA标签融合表达载体框架较小，全长4055bp，适用于植物原生质体转化。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种HA标签融合表达载体的制备方法及其应用。

背景技术

HA标签是一段来源于人流感病毒血凝素蛋白的第98-106位氨基酸的短序列，它的氨基酸序列为YPYDVPDYA，分子量为1.1KDa。在蛋白质表达、蛋白质互作等研究中,可以通过DNA重组技术将所要研究的目的基因和HA标签序列连接起来，HA标签可以连接在目的蛋白的C端或N端，然后将“目的基因-HA”融合后的表达载体转入细菌、酵母、动物或者植物细胞中。因为HA标签的分子量很小，所以不会遮盖住融合蛋白中的蛋白表位和结构域，也不容易改变融合蛋白的功能、定位、分泌和运输等，这使得HA成为目前广泛应用的标签之一。此外，HA标签蛋白能形成强烈的抗体识别位点，目前HA标签蛋白的抗体已经商业化生产，很多品牌如国外品牌Sigma、Abcam和国产品牌Abmart、翌圣等的抗HA标签抗体已广泛用于HA标记的靶蛋白的检测、定量、定位或者蛋白互作研究，检测手段有免疫荧光,免疫印记等。

目前植物中HA标签融合表达载体应用较广泛的多为pCambia1300框架，该载体框架较大，改造后的载体常达10Kb以上。该框架多用于农杆菌介导的烟草植株的转化。尽管应用这种方法可以得到大量表达的“目的基因-HA”融合蛋白，但是烟草育苗周期长，农杆菌介导的转化步骤繁杂。另外，烟草系统无法模拟不同植物本身环境，而对蛋白功能和蛋白互作的研究，特别是利用“目的基因-HA”融合蛋白载体系统寻找目的基因在植物体内的互作蛋白时，要求“目的基因-HA”融合载体要在所研究的目标植物中表达，此时农杆菌介导的转化方法在其它植物如拟南芥、水稻、玉米中的应用受到阻碍。

PEG介导的植物原生质体转化是目前应用较多的融合载体表达系统，但是pCambia1300框架太大，转化效率低，且pCambia1300框架拷贝数低，无法满足原生质体转化系统的大量质粒要求。因此，在实际分子生物学研究中急需一种能用于植物原生质体高效转化和表达的HA标签融合表达载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种HA标签融合表达载体的制备方法及其应用，该方法制备的HA标签融合表达载体pProto-HA框架较小，全长4055bp，适用于植物原生质体转化。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种HA标签融合表达载体的制备方法，该方法为：

S1、用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体，在温度为37℃的条件下反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.8Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物；