[发明专利]一种HA标签融合表达载体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种HA标签融合表达载体的制备方法，其特征在于，该方法为：

S1、用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体，在温度为37℃的条件下反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.8Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物；

S2、以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，以特异性引物F1和特异性引物R1为引物进行PCR反应克隆2×35S启动子，PCR扩增后，将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，切下677bp大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到2×35S启动子PCR回收产物；PCR反应体系为：2×Pfu Master Mix 10μL，特异性引物F11μL、特异性引物R11μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；PCR扩增的反应条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸40s，扩增40个循环；68℃延伸10min；所述特异性引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述特异性引物R1核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

S3、利用同源重组方法将S2中得到的2×35S启动子PCR回收产物中的2×35S启动子连接至S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物中pGL3 Basic载体的KpnI/XhoI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S连接产物，将所述pGL-35S连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S；

S4、将S3中得到的中间载体pGL-35S用XhoI/SalI双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.67Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物；

S5、人工合成多克隆位点MCS正向引物和多克隆位点MCS反向引物，将所述多克隆位点MCS正向引物和所述多克隆位点MCS反向引物在95℃的条件下退火5min，得到MCS退火引物；所述多克隆位点MCS正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述多克隆位点MCS反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

S6、将S5中得到的MCS退火引物T4连接至S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物中pGL-35S的XhoI/SalI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-MCS连接产物；将所述pGL-35S-MCS连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS；

S7、克隆Nos Ter序列：以pCambia1302质粒为模板，以特异性引物F2和特异性引物R2为引物进行PCR反应克隆Nos Ter序列，PCR扩增后，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，切下251bp大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到Nos Ter序列PCR回收产物；PCR反应体系为：2×Pfu Master Mix 10μL，特异性引物F21μL、特异性引物R21μL、pCambia1302质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；PCR扩增的反应条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；所述特异性引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述特异性引物R2核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

S8、将S6中得到的中间载体pGL-35S-MCS用EcoRI/SalI双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.72Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物；

S9、利用同源重组方法将S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物中的Nos Ter序列连接至S8中得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物中的pGL-35S-MCS的EcoRI/SalI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S-MCS-Nos连接产物，将所述pGL-35S-MCS-Nos连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS-Nos；

S10、将S9中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Nos用BglII/BamHI双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.97Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到BglII/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物；

S11、体外人工合成连接肽Linker正向引物和连接肽Linker反向引物，将所述连接肽Linker正向引物和所述连接肽Linker反向引物在温度为95℃的条件下退火5min，得到变性退火的连接肽Linker引物；所述连接肽Linker正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述连接肽Linker反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

S12、将S11中得到的变性退火的连接肽Linker引物T4连接至S10中得到的BglII/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物中pGL-35S-MCS-Nos的BglII/BamHI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-MCS-Linker-Nos连接产物；将所述pGL-35S-MCS连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS-Linker-Nos；

S13、将S12中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Linker-Nos用BamHI/EcoRI双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.01Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到BamHI/EcoRI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Linker-Nos的回收产物；

S14、合成HA标签正向引物和HA标签反向引物，将所述HA标签正向引物和所述HA标签反向引物在温度为95℃的条件下退火5min，得到HA标签退火引物；所述HA标签正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述HA标签反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

S15、将S14中得到的HA标签退火引物T4连接至S13中得到的BamHI/EcoRI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Linker-Nos的回收产物中pGL-35S-MCS-Linker-Nos的BamHI/EcoRI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-MCS-Linker-Nos连接产物；将所述pGL-35S-MCS连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到HA标签融合表达载体，命名为HA标签融合表达载体pProto-HA；所述HA标签融合表达载体pProto-HA的核苷酸如SEQ ID NO:11所示。