[发明专利]一种固定化载体、D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶及制备方法

说明书

本发明公开了一种固定化载体、D‑乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶及制备方法。本发明所述的固定化载体包括质量比为1～3:2～4:4～6的甘草酸二钾、脱乙酰壳多糖以及硅藻土制备的载体；所述载体置于质量浓度为4.5～5.5％的戊二醛溶液中固定8～12h得到固定化载体。本发明以甘草酸二钾与脱乙酰壳多糖、硅藻土共絮凝吸附，形成的复合壳聚糖载体，具有较好的机械强度，固定化载体过滤可操作性好。本发明制备的D‑乙酰亮氨酸脱乙酰酶具有较好的稳定性，可反复使用20次以上。

技术领域

本发明属于涉及生化工程技术领域，具体涉及一种固定化载体、D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶及制备方法。

背景技术

D-亮氨酸的制备采用发酵-消旋-酰化酶法拆分法，该路线需要使用发酵生产的L-亮氨酸作为原料，经消旋，然后再乙酰化工序，得到N-乙酰-DL-亮氨酸，后经过D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶选择性水解后可以得到D-亮氨酸。D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶固定化后可以提高酶的稳定性，使得催化过程容易控制，且极易与反应体系分离，产品的收率高、质量好；同时，固定化酶可以重复使用使得使用效率提高而成本降低。固定化酶所用的材料，多为卡拉胶、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺等材料，而对于采用壳聚糖交联戊二醛固定化酶多有使用，但脱乙酰程度不完全，交联酶的载量和强度不够。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术存在的不足，本发明提供了固定化载体、D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶及制备方法。本发明采用甘草酸二钾与脱乙酰壳多糖、硅藻土共絮凝吸附，形成的复合壳聚糖载体，具有较好的机械强度和比表面积，再经戊二醛交联后形成固定化目标酶的固定载体。本发明的固定化酶载体用于固定D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶，使得D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶具有较好的稳定性，并促进甘草提取物的应用。

技术方案：本发明所述的一种固定化载体，包括质量比为1～3:2～4:4～6的甘草酸二钾、脱乙酰壳多糖以及硅藻土制备的载体；所述载体置于质量浓度为4.5～5.5％的戊二醛溶液中固定8～12h得到固定化载体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述载体通过以下方法制备：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体。

本发明所述的固定化载体的制备方法，包括以下步骤：

(S1)：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体；

(S2)：取步骤(S1)制备的载体，加入到4～8倍质量比的4.5～5.5％的戊二醛溶液中，室温条件下150～200r/min搅拌反应8～12h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到固定化载体。

本发明所述的D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

(SS1)：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体；

(SS2)：取步骤(S1)制备的载体，加入到4～8倍质量比的4.5～5.5％的戊二醛溶液中，室温条件下150～200r/min搅拌反应8～12h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到固定化载体；

(SS3)：取步骤(SS2)制备的固定化载体，加入D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶溶液，4～10℃条件下150～200r/min搅拌8～12h，过滤，并用蒸馏水充分清洗后得到固定化酶。

作为本发明的一种优选实施方式，所述D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶溶液通过以下方法制备：将重组表达D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶的工程菌发酵液离心，收集得到菌泥，将菌泥混悬于6～10倍质量比的磷酸盐缓冲液溶液中，进行高压均质，制备得到破壁粗酶溶液。