[发明专利]一种香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法

说明书

本发明提供了一种香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，包括以下步骤：(1)转录因子获取；(2)番茄遗传转化；(3)转录因子功能验证：将独立转化的MaNAC25和MaNAC28过表达品系作为实验果实，野生型的番茄果实作为对照果实，将实验果实和对照果实低温贮藏，评估比较实验果实和对照果实冷害发生的程度，验证NAC转录因子对于香蕉果实耐冷性的调控作用。本发明从香蕉果实发生冷害的内在调控入手应用转基因番茄果实进行功能验证，具有研究深度和广度，为果实优良品种选育、优化果实冷害控制技术等研究方向提供科学依据和新材料。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法。

背景技术

香蕉是热带和亚热带的重要水果，因其产量高、果肉香甜、营养丰富而深受人们喜爱。香蕉是一种典型的呼吸跃变型果实，在采后常温下呼吸过程加速，迅速释放乙烯，产生的乙烯气体进一步加速了香蕉果实的成熟，进而促进了可溶性固形物含量的增加，香蕉果实逐渐软化，这会促进病原微生物的侵染，最终导致香蕉果实发生病害，严重影响了香蕉果实的货架期，也是香蕉果实采后贮藏保鲜的限制因素。然而，低温贮藏可以延缓果实成熟、防止病原菌入侵和生长，是香蕉果实以及其他园艺产品常用的采后贮藏方法。但香蕉果实是冷敏感水果，贮藏在13℃以下的温度下极易发生冷害。香蕉果实发生冷害的程度与成熟度、果实采收状况、品种、贮藏温度以及贮藏时间有关。香蕉果实发生冷害主要表现为果皮褐变、果肉粉化、异常成熟、易于腐烂等症状，严重影响了香蕉果实的风味品质和食用价值及货架期，并限制了香蕉果实的贮藏和运输，因此更好地了解香蕉果实采后低温贮藏的生理反应以及改进保鲜技术是目前香蕉果实冷链物流运输和采后贮藏的迫切需求。

转录因子是一类可通过识别结构基因启动子中特异的顺式作用元件而调节结构基因转录的调控因子，NAC转录因子参与调节各种非生物胁迫，并通过在非生物胁迫期间上调或下调下游靶基因的表达而充当转录激活因子或抑制因子，从而导致胁迫耐受性或胁迫敏感性表型，香蕉果实发生冷害受内在转录因子调控。探究果实冷害发生的内在调控机制，以及外源物质应用对果实冷害发生的内在调控机制的作用具有重要的现实意义。但果实内在调控难以控制且极其复杂，现有技术无法对调控香蕉果实耐冷性的NAC转录因子基因进行功能验证。

发明内容

本发明所要解决的问题是如何对调控香蕉果实耐冷性的NAC转录因子基因进行功能验证。

为解决上述技术问题，本发明提供一种香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，包括以下步骤：

(1)转录因子获取：从香蕉果实中获得两个具有转录激活活性的NAC转录因子MaNAC25和MaNAC28，MaNAC25的编码区序列如SEQ ID NO.1所示，MaNAC28的编码区序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)番茄遗传转化：将MaNAC25和MaNAC28的编码区序列克隆到带有β-葡萄糖醛酸酶报告基因的植物二元载体pLP100-35S中，生成过表达载体LB-35S:GUS-35S:MaNAC25-RB和LB-35S:GUS-35S：MaNAC28-RB，pLP100-35S的序列如SEQ ID NO.3所示；通过农杆菌介导将重组载体转化到Micro-Tom番茄果实中；通过抗性筛选阳性转化体，并通过RT-qPCR检测MaNAC25和MaNAC28表达以及蛋白质印迹法鉴定；

(3)转录因子功能验证：将独立转化的MaNAC25和MaNAC28过表达品系作为实验果实，野生型的番茄果实作为对照果实，将实验果实和对照果实低温贮藏，评估比较实验果实和对照果实冷害发生的程度，验证NAC转录因子对于香蕉果实耐冷性的调控作用。