[发明专利]一种香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法

权利要求书

1.一种香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)转录因子获取：从香蕉果实中获得两个具有转录激活活性的NAC转录因子MaNAC25和MaNAC28，MaNAC25的编码区序列如SEQ ID NO.1所示，MaNAC28的编码区序列如SEQ IDNO.2所示；

(2)番茄遗传转化：将MaNAC25和MaNAC28的编码区序列克隆到带有β-葡萄糖醛酸酶报告基因的植物二元载体pLP100-35S中，生成过表达载体LB-35S:GUS-35S:MaNAC25-RB和LB-35S:GUS-35S：MaNAC28-RB，pLP100-35S的序列如SEQ ID NO.3所示；通过农杆菌介导将重组载体转化到Micro-Tom番茄果实中；通过抗性筛选阳性转化体，并通过RT-qPCR检测MaNAC25和MaNAC28表达以及蛋白质印迹法鉴定；

(3)转录因子功能验证：将独立转化的MaNAC25和MaNAC28过表达品系作为实验果实，野生型的番茄果实作为对照果实，将实验果实和对照果实低温贮藏，评估比较实验果实和对照果实冷害发生的程度，验证NAC转录因子对于香蕉果实耐冷性的调控作用。

2.根据权利要求1所述的香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，其特征在于，所述步骤(2)中，应用同源重组法构建MaNAC25过表达载体，正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，其特征在于，所述步骤(2)中，应用同源重组法构建MaNAC25过表达载体，正向引物序列如SEQ ID NO.6所示，反向引物序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求1所述的香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，其特征在于，所述步骤(3)中，低温贮藏温度为3-5℃，贮藏时间为20-40d。

5.根据权利要求4所述的香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，其特征在于，所述步骤(3)中，评估比较实验果实和对照果实冷害发生的程度步骤所用指标包括：外观性状、失水率、相对电导率、丙二醛含量、过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性。

6.根据权利要求1所述的香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，其特征在于，所述步骤(2)中，通过农杆菌介导将重组载体转化到Micro-Tom番茄果实中的步骤具体包括：番茄种子经酒精消毒、无菌水清洗后放入盛有水的组培瓶中放置在摇床上摇至种子发芽，转移至种子培养基，一周后长出实生苗，取子叶、下胚轴小段在预培养基上暗培养1天作为预培养的外植体；准备含有抗生素的GV3101农杆菌液28℃暗培养摇菌24h，取1-2ml加入不含有抗生素的20ml LB重新活化至适宜浓度，作为侵染培养基；将侵染培养基与外植体共培养，黑暗处理2天。

7.根据权利要求1所述的香蕉果实耐冷性转录因子基因功能验证方法，其特征在于，所述步骤(2)中，通过抗性筛选阳性转化体步骤具体包括：将外植体转置初筛培养基中，组培室培养，光周期为18/6，温度为25℃，湿度为60％；每两周换一次新的培养基，转移2次后，转入分化培养基中；再每两周换一次新的培养基，达到生根要求后，转入生根培养基；待长出幼苗进行鉴定；经过鉴定的幼苗重新进行上述步骤获得阳性转化体。